復方穿蛭透皮貼對家兔骨關節炎的作用機制

王麗娜　王冬梅　宋紅敏　齊佳悅　王新成　(吉林醫藥學院，吉林　吉林　132013)

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復方穿蛭透皮貼對家兔骨關節炎的作用機制

王麗娜王冬梅宋紅敏齊佳悅王新成(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的研究探討復方穿蛭透皮貼對家兔實驗性骨關節炎作用機理。方法健康清潔級新西蘭白兔，隨機分為空白組、模型組和治療組。治療組及模型組進行改良Hulth法造模。造模成功后，治療組予復方穿蛭透皮貼右膝關節外敷，2d 1次，4 w后分別進行X線和HE染色檢查，并抽取3組關節液，用ELISA法檢測白細胞介素( IL)－1β、IL－6、腫瘤壞死因子( TNF)－α和前列腺素( PG) E2的含量。結果治療組經X線檢查，股骨髁、脛骨平臺關節緣呈現唇樣骨質增生不同程度變小，關節間隙寬，軟骨下骨質密度淡化; HE染色較均勻，關節軟骨表面平滑，關節軟骨表層細胞排列輕度變形;關節液中IL－1β、IL－6、TNF－α和PGE 2的含量的含量水平顯著下降( P＜0．05)。結論復方穿蛭透皮貼對骨關節炎有一定的抑制作用。

〔關鍵詞〕復方穿蛭透皮貼;骨關節炎;細胞因子

骨關節炎( OA)患者常出現局部關節的疼痛、腫脹及功能障礙等癥狀，嚴重地影響生活質量。研究發現〔1〕，細胞因子白細胞介素( IL)－1、IL－8、IL－6、腫瘤壞死因子( TNF)－α和前列腺素( PG) E2等是骨關節炎癥反應的主要因素〔1～3〕。復方穿蛭透皮貼處方由中藥甲珠、阿魏、三七、水蛭等十余味藥材組成，臨床治療OA療效顯著。現代藥理研究表明，阿魏、水蛭、三七均具有抗炎作用;水蛭注射液可以明顯降低腦組織TNF－α和IL－1β的含量，能夠抗腦缺血后炎癥反應，從而起到腦保護作用;三七皂苷可以明顯抑制炎癥引起的脂質沉積的增加，同時減少炎癥細胞因子TNF－α和IL－1的產生〔4，5〕。本實驗旨在研究現代純中藥制劑復方穿蛭透皮貼對兔膝OA細胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的影響及作用機制。

1材料與方法

1. 1動物資料新西蘭白兔36只(購于吉林醫藥學院實驗動物中心)，體質量2．0～2．5 kg，雌雄各半，室溫下飼養。隨機分為空白組，模型組和治療組，每組12只。除空白組外，模型組和治療組造模之后，開始連續給藥4 w，模型組不作任何處理，治療組用透皮貼( 0．45 g/每貼)貼敷患側膝關節，紗布固定，每2 d換藥1次。復方穿蛭透皮貼(自制) :實驗用中藥材均購于吉林大藥房，經質量檢查，符合《中國藥典》2010年版(Ⅰ部)相關項下規定。試劑IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的ELISA試劑盒，購于上海慧穎生物科技有限公司。

1. 2動物模型制備采用改良Hulth法造模。將實驗兔右膝關節消毒麻醉后進行膝前內側切口，使關節暴露并切斷關節前交叉韌帶及內側半月板，止血，關閉傷口。術后不固定患肢，使其于標準動物飼養籠中自由活動并可進食。術后肌注青霉素20萬U，傷口連續7 d換藥。術后1 w每日強迫活動30 min，分2次驅趕，4 w后可獲得OA模型。

1. 3取材及處理治療前和末次治療后，分別拍攝兔右膝關節X線側位片。空白組、模型組以生理鹽水1 ml右后腿膝關節腔注射，治療組右膝關節貼敷，并用紗布固定，2 d換藥1次，共4 w后，抽取右后腿膝關節液。施行膝關節穿刺，證實刺入關節腔后，注入0．9%的生理鹽水0．5 ml，反復回抽、注入3次后，再盡量抽出腔內液體。抽取關節液后，每只兔肌注2萬U慶大霉素，以防膝關節感染。各實驗兔獲得標本量在0．4～0．6 ml，平均0．5 ml，于－20℃低溫冰箱中保存待測。空氣栓塞處死實驗兔，取股骨端進行病理學觀察。

1. 4蘇木素－伊紅( HE)染色每例標本經10%甲醛固定，10%硝酸脫鈣后，取材得到股骨內側髁矢狀剖面標本1塊。經石蠟包埋，切片后，用HE染色，置顯微鏡下觀察。

1. 5檢測方法采用雙抗體ELISA法測定IL－1β、IL－6、TNF－α 及PGE2:關節液標本處理加樣后，置于4℃恒溫箱內靜置24 h，取出加入分離劑充分混勻，4℃溫度下離心2 min，棄去上清液，由自動放免測量儀測定樣品濃度。

1. 6統計學方法采用SPSS12．5統計學軟件進行單因素方差分析。

2結果

2. 1 X線檢查空白組膝關節內外側間隙均勻一致，股骨髁、脛骨平節面輪廓清晰;模型組股骨髁、脛骨平臺關節緣出現唇樣骨質改變，關節間隙變窄;治療組股骨髁、脛骨平臺關節緣呈現唇樣骨質增生不同程度變小，關節間隙寬，軟骨下骨質密度淡化。見圖1。

圖1兔膝骨關節X線片

2. 2 HE染色空白組關節軟骨面光滑整齊，無裂隙或缺損，軟骨細胞數量中等，排列整齊，間質均勻。模型組關節軟骨組織嚴重破壞，關節軟骨表面缺損，軟骨表面粗糙，可見表層基質有丟失，軟骨基質染色不均，細胞分布不均勻。關節軟骨發生了退變，膝OA模型成功。治療組關節軟骨表面平滑，細胞部分缺失，分層較清楚，關節軟骨表層細胞排列輕度變形，染色較均勻。見圖2。

2. 3細胞因子測定模型組關節液中細胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的含量與空白組差異均顯著( P＜0．05) ;治療組與模型組差異顯著( P＜0．05)。見表1。

圖2兔膝骨關節HE染色(×100)

表1各組關節液中細胞因子水平比較(±s，ng/ml，n=12)

表1各組關節液中細胞因子水平比較(±s，ng/ml，n=12)

與空白組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;與模型組比較: 3) P＜0．05，4) P＜0．01

組別　IL－1β　IL－6　TNF－α　PGE2空白組　5．128±1．427　 11．475±0．125　 1．211±3．524　 3．127±6．354模型組　27．012±0．2451)36．587±0．3652)15．204±3．0121)26．104±1．9571)治療組14．396±1．2871) 3)20．042±2．5411) 4)11．144±0．7822) 3)23．210±0．6732) 3)

3討論

復方穿蛭透皮貼具有活血化瘀、通絡止痛的作用。該制劑是在傳統貼膏劑穿蛭膏的基礎上，改進制劑工藝，加入透皮吸收促進劑促進藥物有效成分的釋放、吸收，使制劑臨床療效明顯提高。本實驗結果表明，復方穿蛭透皮貼能夠抑制細胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的釋放，改變軟骨細胞代謝環境并對OA具有抑制作用。此外，復方穿蛭透皮貼與其傳統膏劑穿蛭膏相比較，其對細胞因子IL－1β和TNF－α的抑制率分別提高了8．2%和9．0%〔6〕，說明采用現代制劑工藝，利用經皮給藥技術，制劑處方中加入促進吸收滲透劑可顯著提高制劑療效。

4參考文獻

1賈乙，李曉輝．炎癥因素在泡沫細胞形成中的作用及三七皂苷對其影響〔J〕．第三軍醫大學學報，2005; 27( 10) : 972－4．

2鄭筱英．中藥新藥臨床研究指導原則2001版〔M〕．北京:中國醫藥科技出版社，2001: 326－8．

3梁健芬，董少龍，竇維華，等．水蛭注射液對大鼠腦缺血再灌注后TNF－α、IL－1β和ICAM－1蛋白表達的影響〔J〕．陜西醫學雜志，2006; 35( 12) : 1605－7．

4 Martel Pelletier J，Boileau C，Pelletier JP，et al．Cartilage in normal and osteoarthritis conditions〔J〕．Best Pract Res Clin Rheumatol，2008; 22 ( 2) : 251－84．

5賀牡丹，王小平，陳同生．白介素－1β誘導關節軟骨細胞凋亡的分子機理〔J〕．中國細胞生物學學報，2011; 33( 1) : 49－54．

6曲保忠，楊帆，孫鵬飛，等．穿蛭膏對家兔實驗性骨關節炎細胞因子IL－1β和TNF－α的影響〔J〕．時珍國醫國藥，2011; 2( 6) : 1424－5．

〔2014－11－29修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:王新成( 1968－)，男，副主任技師，主要從事中藥新藥研發研究。

基金項目:吉林省教育廳重點資助項目(吉教科合字〔2011〕第283號)

〔中圖分類號〕R285. 5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0290-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 015

第一作者:王麗娜( 1978－)，女，副教授，碩士，主要從事中藥制劑與質量標準研究。