杜仲黃酮對H22小鼠的抑瘤作用及其機制

袁帶秀舒麗霞　黃　蓉　(吉首大學醫學院，湖南　吉首　46000)

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杜仲黃酮對H22小鼠的抑瘤作用及其機制

袁帶秀1舒麗霞黃蓉(吉首大學醫學院，湖南吉首416000)

1吉首大學植物資源與利用湖南省高校重點實驗室

第一作者:袁帶秀( 1975－)，女，碩士，高級實驗師，主要從事民族藥用植物生理生化研究。

〔摘要〕目的研究杜仲黃酮體內抗腫瘤作用，探討其可能作用機制。方法將小鼠肝癌H22細胞經體外培養并于昆明小鼠腹腔內傳代后，無菌接種于小鼠皮下，建立荷瘤小鼠模型。采取不同劑量杜仲黃酮( 200、100、50 mg/kg) ig給藥，每天1次，連續12 d; CTX組隔日ip給藥，給藥6次，計算抑瘤率、脾臟指數;分離血清，ELSA法檢測血清腫瘤壞死因子( TNF)－α和白細胞介素( IL)－2，比色法檢測血清總抗氧化活力( T－AOC)和丙二醛( MDA)水平。結果與模型組比較，杜仲黃酮能顯著降低移植瘤瘤質量( P＜0．05)，明顯升高荷瘤小鼠的脾臟指數( P＜0．05)，升高血清IL－2、TAOC水平，降低TNF－α、MDA水平。結論杜仲黃酮對H22移植瘤有一定的抑制作用，其機制可能與其調節IL－2和TNF－α等細胞因子的分泌，增強荷瘤小鼠免疫功能，提高機體抗氧化能力有關。

〔關鍵詞〕杜仲;黃酮; H22;抗腫瘤;抗氧化

杜仲具補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等諸多功效。現代藥理學研究認為，杜仲中含有黃酮等多種生物活性物質，具有抗癌、抗衰老、降血壓、抗菌消炎、增強機體免疫等多種藥理作用〔1〕。本研究探討杜仲黃酮體內抑瘤作用及可能機制。

1材料與方法

1. 1材料雄性昆明小鼠，體質量18～22 g，清潔級，合格證號: SCXK(湘) 2011－0003，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供;小鼠H22肝癌細胞株由華中科技大學同濟醫學院藥理系惠贈。注射用環磷酰胺( CTX)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;小鼠白細胞介素( IL)－2、腫瘤壞死因子( TNF)－αELSA試劑盒購自上海勁馬實驗設備有限公司;蛋白質試劑盒、丙二醛試劑盒( MDA)和總體抗氧化活力( T－AOC)試劑盒均購自南京建成生物技術研究所。杜仲葉采自吉首大學資源與環境學院教學樓旁邊，由該院陳功錫教授鑒定。

1. 2方法

1. 2. 1杜仲黃酮的制備將杜仲葉烘干，粉碎機將其粉碎后用65%乙醇超聲提取，提取液過濾;所得濾液置旋轉蒸發器進行濃縮，再在濃縮液中加入石油醚進行除脂分液，把分液后的濾液下層倒入大孔樹脂，靜態吸附2 h以上，再用去離子水洗脫，90%左右乙醇解析2 h以上;解析液再進行濃縮;用異丙醇洗2次，過濾，將濾液濃縮;加入甲醇除雜，最后得棕黃色的杜仲總黃酮。以蘆丁做對照，紫外分光光度計測得杜仲總黃酮的純度為83．61%。

1. 2. 2 H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立常規方法復蘇H22小鼠肝癌細胞，取0．2 ml細胞懸液注射到雄性昆明小鼠腹腔內，連續傳兩代。無菌操作取第2代腹水，用無菌生理鹽水稀釋，調整細胞密度為1×106個/ml，于昆明小鼠右股部行皮下無菌接種，接種量為每只0．2 ml。

1. 2. 3實驗動物分組及處理接種24 h后稱重分組，將小鼠隨機分為杜仲黃酮高、中、低劑量( 200、100、50 mg/kg)組和CTX組;每組10只。杜仲黃酮各給藥組ig給藥，每日1次，共12次; CTX組按20 mg/kg劑量隔日ip給藥1次，共6次;模型組則以生理鹽水替代藥物ig給以小鼠藥。各組動物給藥第12天停藥，禁食不禁水16 h后處死。另取10只正常小鼠設為對照組，每天ig生理鹽水，共12 d。

1. 2. 4小鼠H22肝癌皮下移植瘤的抑瘤率、免疫器官指數以及血清相關指標的測定分別稱取小鼠體質量、瘤質量，計算抑瘤率。并稱取脾臟質量，計算脾臟指數。眼眶取血，分離血清，酶聯免疫吸附試驗( ELISA)法檢測血清TNF－α和IL－2，比色法檢測血清T－AOC和MDA水平。抑瘤率= (模型組瘤質量－藥物組瘤質量) /模型組瘤質量;脾臟指數=脾臟質量/體質量。

1. 3統計學分析利用SPSS16．0統計軟件行單因素方差分析及q檢驗。

2結果

2. 1對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響杜仲黃酮對昆明小鼠H22實體瘤的生長具有一定的抑制作用，其抗腫瘤效應呈劑量依賴性，高劑量組的抑瘤率低于CTX組;與模型組比較，CTX組和杜仲黃酮高、中劑量組荷瘤小鼠瘤質量顯著減輕( P＜0．05)，而杜仲黃酮高、中、低各劑量間無顯著差異( P＞0．05)。見表1。

表1杜仲黃酮對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用(±s，n=10)

表1杜仲黃酮對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用(±s，n=10)

與模型組比較: 1) P＜0．05

組別　　瘤質量( g)　　抑瘤率( %)模型組　1．03±0．19　　－CTX組　0．41±0．051)　60．20杜仲黃酮低劑量組　0．66±0．12　35．90杜仲黃酮低中量組　0．57±0．121)　44．70杜仲黃酮高劑量組　0．54±0．121)　47．60

2. 2對荷瘤小鼠體質量及脾臟指數的影響實驗末期杜仲黃酮高劑量組小鼠體質量、脾臟指數與模型組比較差異顯著( P＜0．05)。杜仲黃酮高劑量組小鼠體質量、脾臟指數與CTX組比較差異顯著( P＜0．05)。杜仲黃酮中劑量組脾臟指數與CTX組比較差異顯著( P＜0．05)。但杜仲黃酮各劑量組小鼠體質量、脾臟指數之間比較差異不顯著( P＞0．05)。CTX組小鼠脾臟指數低于模型組，也低于杜仲黃酮各組，但差異不顯著( P＞0．05)。見表2。

2. 3對荷瘤小鼠血清TNF－α和IL－2水平的影響與對照組比較，模型組、CTX組及杜仲黃酮各劑量組小鼠TNF－α水平顯著升高( P＜0．05)，IL－2水平顯著降低( P＜0．05)。與模型組比較，CTX組和杜仲黃酮高劑量組小鼠TNF－α水平顯著降低( P＜0．05)，而杜仲黃酮高、中劑量組小鼠IL－2水平顯著升高( P＜0．05)。見表3。

2. 4對荷瘤小鼠血清抗氧化指標的影響與對照組比較，模型組小鼠血清MDA水平顯著升高( P＜0．05)，但T－AOC水平變化差異不顯著。與模型組比較，CTX組小鼠血清MDA水平顯著降低( P＜0．05)，杜仲黃酮高、低劑量組小鼠血清T－AOC水平顯著升高( P＜0．05) ;杜仲黃酮高、低劑量組小鼠血清T－AOC也明顯高于CTX組( P＜0．05) ;杜仲黃酮高劑量組T－AOC與其低、中劑量組比較差異顯著( P＜0．05)。見表3。

表2杜仲黃酮對H22荷瘤小鼠的體質量及脾臟指數的影響(±s，n=10)

表2杜仲黃酮對H22荷瘤小鼠的體質量及脾臟指數的影響(±s，n=10)

與模型組比較: 1) P＜0．05;與CTX組比較: 2) P＜0．05

組別　　體質量( g)實驗前　　實驗后脾臟指數( mg/g)模型組　19．90±0．16　 30．77±2．68　 3．78±0．49 CTX組　20．13±0．05　 30．53±1．96　 3．10±0．31杜仲黃酮低劑量組　20．00±0．17　 31．34±1．94　 4．23±0．31杜仲黃酮中劑量組　19．94±0．07　 32．44±2．15　 4．90±0．522)杜仲黃酮高劑量組　20．11±0．20　 33．28±2．001) 2)5．22±0．611) 2)

表3杜仲黃酮對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平和抗氧化指標的影響(±s，n=10)

表3杜仲黃酮對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平和抗氧化指標的影響(±s，n=10)

與對照組比較: 1) P＜0．05;與模型組比較: 2) P＜0．05;與CTX組比較: 3) P＜0．05;與杜仲黃酮低、中劑量組比較: 4) P＜0．05

組別　TNF－α( ng/ml)　IL－2( ng/ml)　T－AOC( U/ml)　MDA( nmol/ml)對照組　0．50±0．01　1．36±0．01　8．81±0．77　7．38±0．45模型組　0．79±0．041)　0．98±0．021)　8．19±0．58　12．58±0．801)CTX組　0．61±0．021) 2)　1．08±0．071)　7．69±0．79　9．95±0．251) 2)杜仲黃酮低劑量組　0．73±0．031) 3)　1．02±0．041)　11．76±1．091) 2) 3)　11．24±0．521)杜仲黃酮中劑量組　0．78±0．041) 3)　1．21±0．041) 2)　9．20±0．92　12．09±0．631) 3)杜仲黃酮高劑量組　0．67±0．031) 2) 4)　1．17±0．061) 2) 4)　13．29±1．111) 2) 3) 4)　11．54±0．711)

3討論

黃酮類化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等諸多生理活性〔2〕。本實驗結果顯示，50、100、200 mg/kg劑量的杜仲黃酮ig給藥12 d，均能抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，雖然其抑瘤作用不如CTX( 60%)強，但能減少因化療所致荷瘤小鼠體質量減輕和免疫力下降等不良反應，能夠提高荷瘤小鼠的脾臟指數，增加體質量。

IL－2是由抗原活化的T細胞分泌的一種重要的淋巴因子，在機體的免疫應答和調節中起重要作用〔3〕。IL－2的含量與細胞的免疫功能密切相關，因此，IL－2降低是腫瘤患者細胞免疫功能受損的一項重要標志。本研究發現，肝癌H22移植瘤小鼠血清IL－2水平較正常小鼠顯著降低，而杜仲黃酮給藥后荷瘤小鼠血清IL－2水平明顯升高。說明杜仲黃酮可改善荷瘤小鼠免疫指標，提高機體抗腫瘤能力。

TNF－α是參與機體免疫和炎癥反應的細胞因子〔4，5〕，在機體抗腫瘤過程中發揮重要作用。一方面，TNF－α可通過抑制腫瘤血管生成等間接途徑影響腫瘤細胞生長，另一方面，還可誘導多種腫瘤細胞凋亡〔6〕。本研究結果表明，肝癌H22移植瘤小鼠血清TNF－α水平較正常小鼠升高，而杜仲黃酮給藥后荷瘤小鼠血清TNF－α水平卻降低，趨向于正常水平，說明杜仲黃酮抗腫瘤作用時，可通過誘導細胞凋亡等方式導致腫瘤細胞數目的減少，引起腫瘤細胞分泌到循環系統中TNF－α等細胞因子水平相應降低。因此，TNF－α變化可能反映了杜仲黃酮抗腫瘤作用的藥用效果，至于TNF－α變化本身是否參與了其抗腫瘤的病理生理過程，還需進一步的研究探討。

研究已證明自由基與人類腫瘤的發生，發展及防治密切相關。MDA是脂褐質形成過程中的中間產物，其含量可間接反映機體內自由基的產生情況和細胞的脂質過氧化程度;而T－AOC反映的是機體總的抗氧化能力，它的下降表明機體整體的抗氧化能力降低了。本研究結果顯示，杜仲黃酮能降低H22荷瘤小鼠血清MDA水平，提高T－AOC活力，表明杜仲黃酮抗腫瘤作用還可能與其抗氧化作用有關。

綜上，杜仲黃酮對H22移植瘤有一定的抑制作用，其機制可能與其增強荷瘤小鼠免疫功能，調節IL－2和TNF－α等細胞因子的分泌，提高機體抗氧化能力有關。

4參考文獻

1吳春，胡小妹，陳林林，等．杜仲黃酮的提取及抗氧化活性研究〔J〕．哈爾濱商業大學學報(自然科學版)，2004; 20( 5) : 509－11．

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4唐秀能，張志偉，黃仁彬，等．柿葉水提物抗腫瘤作用實驗研究〔J〕．中國藥師，2009; 12( 1) : 31－3．

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〔2014－05－17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R285. 5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0291-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 016

基金項目:湖南省教育廳科研項目( No．12C0301) ;植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室資助( No．13jdzb095)