毛尖蘑粗多糖對H22荷瘤小鼠的抑廇作用及Bcl－2表達的影響

呂冬霞　羅文哲　張淑紅　王長山　薛　勇　(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江　佳木斯　154007)

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毛尖蘑粗多糖對H22荷瘤小鼠的抑廇作用及Bcl－2表達的影響

呂冬霞羅文哲張淑紅王長山薛勇(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的探討毛尖蘑子實體粗多糖( MJMP)對H22荷瘤小鼠Bcl－2表達的影響。方法建立H22小鼠模型，隨機分為4組，對H22模型小鼠進行MJMP處理，計算腫瘤生長抑瘤率，采用SP免疫組織化學方法檢測小鼠腫瘤組織中Bcl－2蛋白的表達;通過RT－PCR方法檢測腫瘤組織中Bcl－2 mRNA的表達。結果MJMP低、高劑量對小鼠H22移植腫瘤均表現抑制作用，腫瘤抑制率與陰性對照組比較差異顯著( P＜0．01) ;免疫組化證明，MJMP可減少Bcl－2蛋白的陽性細胞百分率，與陰性對照組比較差異顯著( P＜0．01) ;應用RT－PCR方法表明，經過MJMP處理后，Bcl－2 mRNA表達與陰性對照組比較明顯減弱( P＜0．01)。結論MJMP對H22腫瘤的抑制可能與Bcl－2 mRNA及蛋白低表達有關。

〔關鍵詞〕毛尖蘑多糖; Bcl－2;凋亡; H22

肝癌常見的治療手段主要有手術治療、介入治療、放化療、生物靶向治療等方法〔1〕，但同時給機體帶來很多的不良反應。真菌作為天然的藥物和食物，含有的菌類多糖具有抗腫瘤作用〔2～4〕。本研究將毛尖蘑子實體提取的粗多糖( MJMP)作用于H22荷瘤小鼠，采用SP免疫組化學法和RT－PCR法檢測小鼠腫瘤組織中Bcl－2的表達，旨在探討MJMP抑制腫瘤的機制。

1材料和方法

1. 1材料毛尖蘑:大興安嶺呼瑪縣韓家園林業局松濤鹿苑公司;昆明種近交系雌性小鼠:佳木斯大學實驗動物中心(許可證號: SYXK黑2006－004，普通級，普通環境飼養) ; H22小鼠肝癌細胞株:中國醫學科學院腫瘤研究所。Trizol: Gibco公司;淋巴細胞分離液、紅細胞裂解液: Beyotime生物試劑公司;總RNA提取試劑盒、反轉錄cDNA合成試劑盒:大連Takara生物公司;β－actin多克隆抗體:北京博奧森生物有限公司。環磷酰胺( CTX) :江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1. 2動物分組與用藥常規造模，24 h后，隨機分組: MJMP(采用熱水浸提方法改良〔5〕)高劑量組、MJMP低劑量組、陽性對照組( CTX)、陰性對照組(生理鹽水)。各組均灌胃的方式進行藥物處理，藥物劑量均為0．2 ml/d，1次/d，連續給藥14 d。

1. 3腫瘤生長抑瘤率的測定給藥14 d后，斷頸髓處死小鼠，無菌條件下剖取腫瘤實體，稱重，計算腫瘤生長抑瘤率，腫瘤生長抑瘤率= (陰性對照組平均腫瘤重量－給藥組平均腫瘤重量) /陰性對照組平均腫瘤重量×100%

1. 4免疫組化法檢測腫瘤組織Bcl－2蛋白表達取小鼠腫瘤組織常規方法制備免疫組化切片。顯微鏡下觀察蛋白表達情況，隨機選擇5個視野細胞計數，進行定量分析。蛋白表達陽性的細胞為明顯的棕黃色染色，而藍色細胞為陰性細胞。

1. 5 RT－PCR方法檢測腫瘤組織Bcl－2 mRNA的表達按說明書要求提取腫瘤組織細胞總RNA，經RNA鑒定后將逆轉錄產物cDNA進行PCR反應。PCR反應引物為Bcl－2:上游5'－CCTGGCACCTGGCGGATAGC－3'，下游5 '－CGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAAC－3，β－actin:上游5 '－AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG－3'，下游5'－CGCCTA GAAGCACTTGCGGTG－3'。以上PCR樣品取出后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。應用凝膠成像系統掃描分析各條帶，依據各條帶的光密度和面積對擴增產物進行定量分析，以β－actin密度作為參考定量標準，計算Bcl－2/β－actin的值。

1. 6統計學方法應用SPSS11．5軟件進行方差分析( AVONA)、Q檢驗。

2結果

2. 1 MJMP對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用CTX及MJMP低、高劑量對小鼠H22移植腫瘤均表現抑制作用。陰性對照組小鼠的平均腫瘤重量為( 2．739±0．318) g，CTX組和MJMP低、高劑量組小鼠平均瘤重分別為( 1．132±0．187) g、( 1．508±0．240) g和( 1．242±0．217) g，比陰性對照組明顯減少( P＜0．01) ; MJMP低、高劑量組和CTX組的腫瘤抑制率分別是44．94%、54．65%和58．67%。

2. 2 MJMP對H22荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2的蛋白表達Bcl－2陽性表達為黃色陽性細胞。CTX組〔( 40．12±7．62) %〕和高、低劑量組〔( 44．58±6．34) %、( 49．64±6．92) %〕較陰性對照組的Bcl－2〔( 66．33±7．59) %〕差異顯著( P＜0．01)，CTX組和CJMJ治療組Bcl－2陽性細胞百分率表達均明顯減弱。

2. 3 MJMP對H22荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2 mRNA的表達

1、陰性對照組; 2、低劑量組; 3、高劑量組; 4、CTX組圖1 RT-PCR法檢測H22小鼠腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達

見圖1。Bcl－2的mRNA表達在陰性對照組呈過表達( 0．25±0．02)，CTX組和MJMP組的Bcl－2 mRNA表達明顯減弱( 0．15± 0．03、0．16±0．02、0．21±0．02)。

3討論

本試驗結果表明，MJMP和CTX能夠明顯抑制H22荷瘤小鼠肝癌實體瘤的生長，其中低劑量MJMP的抑瘤作用低于CTX。肝癌細胞的Bcl－2基因高表達，可抑制肝癌細胞的凋亡，是肝癌形成的重要因素之一。Bcl－2可與線粒體及內質網膜相結合〔6〕。目前認為Bcl－2主要通過以下幾個途徑體現抑制細胞凋亡的作用: ( 1) Ca2+在細胞內的濃度升高可以導致細胞凋亡，當內質網膜中Bcl－2高表達，可抑制Ca2+在內質網管的釋放，從而影響了細胞凋亡; ( 2)線粒體上的Bcl－2通過抗過氧化反應，保護脂質膜和保持細胞的氧化狀態，抑制氧自由基的產生，來抑制細胞凋亡; ( 3) Bcl－2參與組成線粒體孔道，調節線粒體膜對凋亡蛋白前體的通透性，封閉Bax形成的孔道以達到保護細胞凋亡的目的; ( 4) Bcl－2和Bax兩種蛋白結合，可以抑制細胞凋亡; ( 5) Bcl－2還可以通過阻止線粒體中的細胞色素C釋放，阻斷Caspase蛋白酶的激活，阻止細胞凋亡的級聯反應過程，而抑制細胞凋亡; ( 6) Bcl－2還可能通過控制細胞信號轉導的途徑來抑制細胞的凋亡〔7〕。有研究表明在肝癌細胞中Bcl－2的表達增高，細胞呈高分化，異型性明顯，提示Bcl－2高表達與肝癌細胞的高分化有一定的相關性〔8〕。因此去除或減弱Bcl－2基因產物達到治療的目的，成為肝癌基因治療的一個新靶點，肝癌患者的預后與Bcl－2基因及蛋白表達關系非常密切，臨床上可以指導有效、合理地治療，判斷肝癌的預后。

本試驗結果顯示，MJMP能夠減少H22肝癌細胞中Bcl－2蛋白的表達，可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。

4參考文獻

1中國抗癌協會肝癌專業委員會．原發性肝癌規范化診治專家共識〔J〕．臨床腫瘤學雜志，2009; 14( 3) : 259－69．

2 Hengartner MO．The biochemistry of apoptosis〔J〕．Nature，2000; 407 ( 7) : 770－6．

3周怡，耿越．多糖與凋亡關系探討〔J〕．中草藥，2007; 38( 4) : 623－6．

4李建軍．靈芝多糖免疫調節作用與抗腫瘤作用的關系及作用機制的研究〔D〕．廣州:第一軍醫大學碩士論文，2007．

5范曉艷，呂冬霞，劉爽，等．毛尖蘑粗多糖提取方法的研究〔J〕．黑龍江醫藥科學，2010; 33( 4) : 20－1．

6翟中和，王喜忠，丁明孝．細胞生物學〔M〕．北京:高等教育出版社，2000: 463．

7 Adams JM，Cotry S．The Bcl－2 protein family: arbiters of cell survival 〔J〕．Science，1998; 281( 5381) : 1322－6．

8 Zeppa P，Benincasa G，Fulciniti F，et al．Apoptosis and cytologic differentiation in hepatocellular carcinoma on fine needle aspiration samples〔J〕．Acta Cytol，1996; 40( 5) : 861．

〔2015－06－09修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:羅文哲( 1976－)，男，副教授，碩士，主要從事腫瘤發生機制與生物學治療研究。

基金項目:佳木斯大學重點研究項目( No．Sz2013－002)

〔中圖分類號〕R730. 52

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0298-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 020

第一作者:呂冬霞( 1965－)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤發生機制與生物學治療研究。