那可丁聯合順鉑對人卵巢癌SKOV3細胞增殖及凋亡的影響

申　薇　梁冰鋒秦金金　李秋穎　付雪蓮　程建新(河北醫科大學第四醫院婦產科，河北　石家莊　0500)

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那可丁聯合順鉑對人卵巢癌SKOV3細胞增殖及凋亡的影響

申薇梁冰鋒1秦金金李秋穎付雪蓮程建新
(河北醫科大學第四醫院婦產科，河北石家莊050011)

〔摘要〕目的探討那可丁聯合順鉑對人卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制和凋亡的影響，并探討其可能機制。方法體外培養人卵巢癌SKOV3細胞;用四甲基耦氮唑藍( MTT)法檢測SKOV3細胞增殖情況，流式細胞術檢測分析細胞的周期變化、凋亡率及細胞中S期激酶關聯蛋白2 ( Skp2)與成纖維細胞生長因子－2( FGF－2)的表達情況。結果在一定范圍內，那可丁對SKOV3細胞的增殖有明顯抑制作用，且存在著濃度和時間依賴效應( P＜0．05)。聯合用藥組SKOV3細胞凋亡率〔( 36．45±3．06) %，( 39．56±4．91) %〕高于順鉑組〔( 28．25±3．40) %〕( P＜0．05) ;與對照組相比，SKOV3細胞G0/G1期細胞比例減少( P＜0．05)，G2/M期細胞比例增加( P＜0．05) ;各用藥組SKOV3細胞中Skp2和FGF－2的表達水平均低于對照組( P＜0．05)，其中聯合用藥組又低于順鉑組( P＜0．05)。結論那可丁提高了順鉑對SKOV3細胞的敏感性，其與順鉑聯用具有協同抗腫瘤作用。

〔關鍵詞〕卵巢腫瘤;那可丁;順鉑; S期激酶關聯蛋白2;成纖維細胞生長因子－2

1河北女子職業技術學院護理系

第一作者:申薇( 1980－)，女，主治醫師，博士，主要從事婦科腫瘤診治研究。

卵巢癌嚴重危害女性的生命健康〔1〕。目前，除手術治療外，以鉑類為基礎的聯合化療是治療卵巢癌的主要手段，然而由于化療藥物血液、神經等方面毒副作用以及化療引起的多藥耐藥性，嚴重影響了藥物的化療效果和臨床療效，甚至出現化療失敗〔2～4〕。因此，有必要尋找新型、毒副作用低的化療輔助藥物用以改善鉑類藥物的耐藥性，提高卵巢癌患者的生存率并改善其生活質量。那可丁是一種來自于鴉片的鄰苯二甲酸異喹啉生物堿，結構與秋水仙堿相似，一直作為鎮咳藥使用。近年來，研究證實那可丁具有抗腫瘤活性，并且該藥物與紫杉醇、阿霉素等藥物具有協同抗腫瘤作用〔5，6〕。本研究檢測那可丁與順鉑聯用對細胞增殖、凋亡及S期激酶關聯蛋白2( Skp2)與成纖維細胞生長因子－2( FGF－2)表達的影響。

1材料與方法

1. 1細胞株、試劑和儀器人卵巢癌SKOV3細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心提供。注射用順鉑購自山東齊魯制藥廠，那可丁、胰蛋白酶、碘化丙啶( PI)染液購自美國Sigma公司，PBS緩沖液、RPMI－1640培養液購自美國Gibco公司，二甲基亞砜( DMSO)購自天津化學試劑廠，胎牛血清購自杭州四季青公司，四甲基耦氮唑藍( MTT)購自洛陽華美生物工程公司，Skp2和FGF－2兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司。流式細胞儀，Epics－XLⅡ型，美國Beckman Coulter公司;酶標儀，HT2－125500型，鄭州博賽生物工程公司。

1. 2方法

1. 2. 1細胞的培養與分組將人卵巢癌SKOV3細胞于37℃、5%CO2培養箱內，以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液在培養瓶內單層傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為:只加生理鹽水的對照組;單用那可丁( 5、10、20、40、80、160 μmol/L)組;單用順鉑( 10 μg/ml)組;那可丁與順鉑聯合應用(那可丁20 μmol/L +順鉑10 μg/ml，那可丁40 μmol/L +順鉑10 μg/ml)組。

1. 2. 2 MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數生長期的SKOV3細胞，用0．25%胰蛋白酶消化，調整細胞密度為2．5× 104個/ ml，接種于96孔培養板中，200 μl/孔(含5×103個細胞)，每組設3個平行孔。細胞分別加藥培養24、48和72 h后，加入MTT( 5 mg/ml) 20 μl/孔，繼續培養4 h。棄去上清液，加入DMSO( 200 μl/孔)，振蕩10 min使結晶充分溶解。用酶標儀測其在490 nm波長處的吸光度( OD)值，按以下公式計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率( %) = ( 1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1. 2. 3流式細胞術檢測細胞周期及凋亡率取對數生長期的SKOV3細胞，培養48 h后收集細胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。PBS離心洗滌細胞3次，調整細胞濃度為1×106個/ml，取1 ml細胞懸液，向其中加入PI染液，使其終濃度達到50 μg/ml PI，4℃避光染色30 min后上流式細胞儀檢測。分別應用Muticycle AV軟件和Expo ADC軟件對細胞周期的時相分布和細胞凋亡情況進行分析。

1. 2. 4流式細胞術檢測細胞的蛋白表達取對數生長期的SKOV3細胞，培養48 h后收集細胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。用PBS離心洗滌細胞2次，沉淀細胞后溶于100 μl PBS，分別加入Skp2和FGF－2兔抗人單克隆抗體100 μl，避光靜置60 min，加入鼠抗兔二抗工作液100 μl，對照組只加二抗。避光靜置60 min，流式細胞儀檢測SKOV3細胞中蛋白的表達量，以平均熒光強度表示蛋白的含量。

1. 3統計學方法采用SPSS13．0軟件行方差分析，兩兩組間比較采用LSD法。

2結果

2. 1那可丁對卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加，細胞的增殖抑制率總體呈增高趨勢( P＜0．05)，但那可丁劑量組中40、80、160 μmol/L組間比較無顯著差異( P＞0．05)。那可丁作用于SKOV3細胞24、48、72 h的IC50值分別為46．77、22．66、19．08 μmol/L，隨著作用時間的延長那可丁對SKOV3細胞的增殖抑制作用明顯增強( P＜0．05)，見表1，表明那可丁對SKOV3細胞的抑制存在時間和濃度依賴效應。

表1那可丁作用于SKOV3細胞的增殖抑制率(±s，%，n=3)

表1那可丁作用于SKOV3細胞的增殖抑制率(±s，%，n=3)

與5 μmol/L那可丁組比較: 1) P＜0．05;與10 μmol/L那可丁組比較: 2) P＜0．05;與20 μmol/L那可丁組比較: 3) P＜0．05

那可丁(μmol/L)　 24 h　48 h　72 h 5　11．73±11．71　 15．44±9．36　 17．60±8．21 10　17．11±14．13　 20．97±13．371)　26．46±12．051)20　32．03±15．30　 37．82±9．901) 2)　40．62±4．221) 2)40　 60．59±12．281) 2) 3)　76．51±9．341) 2) 3)　88．83±3．631) 2) 3)80　 61．55±7．861) 2) 3)　88．10±2．641) 2) 3)　92．22±1．341) 2) 3)160　 61．45±5．761) 2) 3)　89．10±2．061) 2) 3)　93．91±1．001) 2) 3)

2. 2那可丁、順鉑及聯合應用對SKOV3細胞凋亡的影響與對照組相比，各用藥組SKOV3細胞的凋亡率均顯著增加( P＜0．05)，其中聯合用藥組又明顯高于那可丁單藥組及順鉑組( P＜0．05)。那可丁單用時，高劑量組高于低劑量組( P＜0．05)，見表2，表明那可丁與順鉑有協同誘導凋亡作用。

2. 3那可丁、順鉑及聯合應用對SKOV3細胞周期的影響與對照組比，那可丁單藥組和聯合用藥組G0/G1期細胞比例減少，G2/M期細胞比例增加( P＜0．05)。隨著那可丁濃度的增加，G0/G1期細胞比例逐漸減少，G2/M期細胞比例逐漸升高，那可丁單劑量組和聯合用藥組內比較有顯著差異( P＜0．05)。那可丁單藥組和聯合用藥組G2/M期細胞比例顯著高于順鉑組( P＜0．05)，表明那可丁對SKOV3細胞具有G2/M期阻滯作用。見表2。

2. 4那可丁、順鉑及聯合應用對SKOV3細胞Skp2和FGF－2蛋白表達的影響與對照組相比，各用藥組Skp2和FGF－2蛋白表達均降低( P＜0．05)。那可丁單用時，高劑量組Skp2和FGF－2蛋白表達低于低劑量組( P＜0．05)。聯合用藥組Skp2和FGF－2蛋白表達顯著低于順鉑組( P＜0．05)，見表3。

表2卵巢癌SKOV3細胞凋亡及周期的變化(±s，%，n=3)

表2卵巢癌SKOV3細胞凋亡及周期的變化(±s，%，n=3)

與對照組比較: 1) P＜0．05;與順鉑組比較: 2) P＜0．01;與20 μmol/L那可丁組比較: 3) P＜0．05;與20 μmol/L那可丁+順鉑組比較: 4) P＜0．05

組別細胞周期G0/G1期　S期　G2/M期　細胞凋亡率對照組　61．77±4．97　21．36±3．61　16．87±2．65　2．87±0．94順鉑組　50．12±10．76　48．03±10．77　1．85±0．25　28．25±3．401)20 μmol/L那可丁組　50．73±2．661)　26．67±2．78　22．53±2．531) 2)　10．59±2．991)40 μmol/L那可丁組　31．77±9．381) 3)　36．27±10．87　32．00±1．801) 2) 3)　19．67±4．011) 3)20 μmol/L那可丁+順鉑組　27．47±5．771)　35．70±11．44　37．17±6．661) 2)　36．45±3．061) 2)40 μmol/L那可丁+順鉑組　6．55±4．591) 4)　38．37±6．95　55．10±6．361) 2) 4)　39．56±4．911) 2)

表3卵巢癌SKOV3細胞中Skp2和FGF-2蛋白的表達(±s，n=3)

表3卵巢癌SKOV3細胞中Skp2和FGF-2蛋白的表達(±s，n=3)

與對照組比較: 1) P＜0．05;與20 μmol/L那可丁組比較: 2) P＜0．05;與順鉑組比較: 3) P＜0．05

組別　Skp2　FGF－2對照組　167．12±7．01　 287．05±10．55順鉑組　141．58±8．541)　260．57±9．231)20 μmol/L那可丁組　151．56±6．191)　268．78±7．561)40 μmol/L那可丁組　134．12±7．331) 2)　250．72±5．211) 2)20 μmol/L那可丁+順鉑組　125．45±3．721) 3)　242．25±4．931) 3)40 μmol/L那可丁+順鉑組　113．75±7．211) 3)　227．62±6．151) 3)

3討論

作為一種微管抑制劑，那可丁通過抑制微管動態不穩定性、干擾腫瘤細胞有絲分裂來抑制腫瘤細胞的增殖〔7〕，從而達到抗腫瘤的作用。那可丁不僅可以抑制非小細胞肺癌、神經膠質細胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種癌細胞的增殖，而且對一些紫杉醇耐藥細胞也有較好的抑制作用，其作用機制目前尚不清楚，可能與抑制G2/M期有絲分裂及激活c－jun－氨基末端激酶( c－JNK)、p21參與、核轉錄因子( NF)－κB信號通路調節、半胱天冬氨酸酶( caspase)級聯反應、B細胞淋巴瘤/白血病－2( Bcl－2)下調等途徑有關。相關動物實驗表明，采用口服、注射等不同的給藥方式，那可丁對心、胸腺、十二指腸、腎、血液和骨髓等器官或組織沒有明顯的毒副作用，且與聯合藥品不產生交叉耐藥〔8，9〕。本研究結果顯示，那可丁可明顯抑制SKOV3細胞增殖，并呈劑量和時間的依賴性。那可丁與順鉑聯用可將SKOV3細胞阻滯于G2/M期，并增加SKOV3細胞的凋亡率，表明那可丁與順鉑聯用具有協同抗腫瘤作用。

耐藥的產生與腫瘤細胞一些蛋白的高表達密切相關，Skp2 與FGF－2均是耐藥相關的蛋白，與腫瘤的發生、浸潤、轉移以及復發密切相關。Skp2是蛋白降解過程中特異的識別底物，介導降解其泛素化，主要調節細胞從細胞周期的G0/G1期進入到S期。它的過表達會導致細胞不斷的進行細胞周期，使本應生理性凋亡的細胞不停地進行分裂，促進了基因的復制和細胞增殖〔10，11〕。FGF－2儲存于腫瘤微環境的細胞外基質和間質細胞中，在細胞周期的轉換中誘導并促進G0/G1期細胞進入S期，促使纖維細胞、上皮細胞和血管內皮細胞的快速增殖與分化。FGF與受體結合形成的二聚體發生磷酸化，可激活自身內在的酪氨酸蛋白激酶活性，活化磷脂酶C－蛋白激酶C( PLC－PKC)、磷脂酰肌醇3激酶－蛋白激酶B( PI3K－PKB)等多種不同的信號轉導通路，促進新生血管生成和正常細胞惡性轉化等多種生物學行為〔12〕。本研究結果顯示，那可丁可明顯降低SKOV3細胞中Skp2和FGF－2蛋白的表達量，提示那可丁可能通過抑制腫瘤組織中Skp2和FGF－2蛋白的表達，從而誘導卵巢癌細胞凋亡。總之，那可丁能抑制人卵巢癌SKOV3細胞的生長，且與順鉑聯合應用對細胞的生長抑制具有協同作用，提示那可丁可考慮作為化療藥物順鉑的輔助用藥，為改善卵巢癌患者的化療效果，尋求新的臨床治療方案提供實驗依據。

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〔2014－06－15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

《中國老年學雜志》被國際數家數據庫、檢索性期刊檢索機構收錄情況

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·心、腦血管及代謝性疾病·

〔中圖分類號〕R737. 31

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0303-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 023