MMP－7在結腸癌侵襲轉移中的作用及其意義

樊曉靜　(新疆醫科大學附屬新疆維吾爾自治區中醫院，新疆　烏魯木齊　830000)

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MMP－7在結腸癌侵襲轉移中的作用及其意義

樊曉靜(新疆醫科大學附屬新疆維吾爾自治區中醫院，新疆烏魯木齊830000)

〔摘要〕目的探討不同分期結腸癌組織及其患者血清基質金屬蛋白酶( MMP)－7的表達差異。方法采用蛋白質免疫印跡方法檢測182例不同臨床分期的結腸癌組織樣本及30例癌旁組織樣本，采用酶聯免疫吸附法同時檢測了這182例結腸癌患者外周血血清的MMP－7蛋白水平，分層分析MMP－7表達與其他臨床參數的相關性，進一步分析MMP－7表達與患者5年無瘤生存預后的臨床聯系。結果結腸癌組織中MMP－7蛋白表達比較:Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，均明顯高于癌旁組織MMP－7的表達( P＜0．01)，其中Ⅲ期結腸癌組織MMP－7表達顯著高于Ⅱ期( P＜0．01) ;不同分期結腸癌患者的血清樣本MMP－7陽性率比較:Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，與結腸癌組織MMP－7表達呈正相關( P＜0．05) ;血清MMP－7陽性與患者年齡、性別、腫瘤部位、病理類型和分化程度無明顯相關性( P＞0．05) ;進一步生存分析示血清MMP－7陽性與患者5年無瘤生存顯著相關，腫瘤分期和血清MMP－7是結腸癌患者5年無瘤生存的危險因素( P＜0．05)。結論MMP－7可能作為結腸癌臨床診斷和分期的生物學標志物，具有預測結腸癌患者5年無瘤生存預后的重要臨床價值，但該結論亟待進一步證實。

〔關鍵詞〕MMP－7;結腸癌;轉移;侵襲

Wnt/β－catenin信號通路的激活是結腸癌發生、發展過程中的重要環節〔1，2〕，基質金屬蛋白酶( MMP)－7作為此通路中參與腫瘤侵襲轉移的重要基因之一，具有破壞細胞外基質的生物學作用〔3〕。本研究通過檢測不同分期結腸癌組織和患者血清中的MMP－7蛋白表達情況，以期明確MMP－7表達與結腸癌侵襲轉移及其臨床預后方面的意義。

1資料和方法

1. 1臨床資料選取本院2009年7月至2011年6月收治并接受結腸癌根治術的182例患者作為研究對象，將相應成功配對的30例癌旁組織作為對照，均成功獲得所有患者的外周血血清樣本。本研究納入的結腸癌及其癌旁組織均經術后病理組織檢查明確診斷，同時依照TNM結腸癌臨床分期標準將182例患者分為4組:Ⅰ組35例;Ⅱ組40例;Ⅲ組51例;Ⅳ組56例，患者KPS評分均在60～80分。4組不同分期結腸癌患者及對照組癌旁樣本對應的人口統計學及臨床病理參數等資料見表1。結腸癌患者或家屬均簽署知情同意書，并經本院倫理委員會批準。

1. 2蛋白質免疫印跡將來源于結腸癌根治術的結腸癌和癌旁組織樣本放于液氮中保存，液氮研磨并經玻璃勻漿器處理后，用SDS蛋白裂解液處理并將收集到的上清轉入EP管中－80℃保存，以備濃度測定。經BCA法標準曲線分析后獲得不同樣本的蛋白質濃度并計算上樣體積，將loading buffer按比例混合和煮沸處理的蛋白樣品等量加入到PAGE膠點樣孔中，待指示線跑至底部時終止，轉膜處理100 V，100 min后終止，三蒸水洗膜后用5%脫脂牛奶封閉(搖床1 h，室溫)，隨后加入一抗4℃過夜孵育(β－actin 1∶1 000，購于杭州聯科生物有限公司; MMP－7 1∶1 000，購于德國Cell Signaling Technology公司)，復溫20 min后洗膜，再加入用5% BSA稀釋的二抗孵育，室溫1 h，洗膜后化學發光，同時采用凝膠圖像分析儀曝光和圖像保存，灰度值用image J軟件進行分析。

表1不同分期結腸癌人口統計學及其臨床資料( n)

1. 3酶聯免疫吸附法0．05 mol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至5 μg/ml，每反應孔加0．1 ml，4℃過夜，棄去孔內液體，洗滌緩沖液3 min，共3次;加待檢樣品0．1 ml于已包被反應孔中，37℃孵育60 min后洗滌;各反應孔中加酶標抗體0．1 ml。37℃孵育45 min后洗滌;各反應孔中加TMB底物溶液0．1 ml以顯色，37℃孵育20 min;各反應孔中加硫酸0．05 ml終止顯色反應;于450 nm波長處測定各反應孔的OD值，大于陰性對照OD值的2．1倍或以上，即視為蛋白表達水平陽性。

1. 4隨訪對182例結腸癌患者進行為期5年的術后隨治，對復發、轉移或死亡情況記錄，將此三類轉歸情況作為隨訪終點事件，以門診或電話等方式收集隨訪數據。所有納入患者均成功參與了5年的無瘤生存預后監測，無失訪者出現，隨訪率達100%。

2結果

2. 1不同分期結腸癌組織MMP－7表達量182例結腸癌組織的MMP－7蛋白條帶灰度值為( 189．12±75．33)，較30例癌旁組織的( 82．18±29．49)明顯增高( t = 7．667，P = 0．000)。不同臨床分期結腸癌組織中的MMP－7蛋白表達比較:Ⅳ期( 224．11± 59．82)＞Ⅲ期( 205．49±49．88)＞Ⅱ期( 150．86±31．27)＞Ⅰ期( 137．24±30．44)，其中Ⅲ期結腸癌組織MMP－7表達顯著高于Ⅱ期( t=6．053，P=0．000)。

2. 2不同分期結腸癌患者血清MMP－7陽性率不同分期血清樣本MMP－7陽性率依次減小，Ⅳ期( 71．4%，40/56)＞Ⅲ期( 62．7%，32/51)＞Ⅱ期( 55．0%，22/40)＞Ⅰ期( 51．4%，18/35)，但四組比較均無統計學意義(χ2= 4．580，P= 0．205)，同時兩兩比較也無統計學意義( P＞0．05)。進一步相關性分析示，結腸癌患者血清樣本MMP－7陽性率與組織樣本MMP－7陽性表達量具有明顯正相關性( P＜0．05)。

2. 3其他臨床參數與MMP－7的相關性結腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、病理類型和分化程度與血清MMP－7陽性均無明顯相關性( P＞0．05)。見表2。

2. 4結腸癌5年無瘤生存與MMP－7的相關性5年隨訪后發現，MMP－7陽性者的5年無瘤生存期和生存率分別為( 48．0± 1．8)個月和69．6%，明顯低于MMP－7陰性者的( 54．4±1．6)個月和82．9%( P=0．038)，采用Cox生存風險模型分析結腸癌患者5年無瘤生存的可能危險因素后發現，腫瘤分期和血清MMP－7與患者5年無瘤生存密切相關，是5年無瘤生存的危險因素。見表3。

表2血清MMP-7陽性與其他臨床參數相關性( n)

表3結腸癌患者5年無瘤生存危險因素的Cox分析

3討論

侵襲轉移是腫瘤致死的關鍵因素，作為我國最常見的惡性腫瘤之一，侵襲性方面的研究已成為結腸癌研究的熱點〔1〕。腫瘤的侵襲轉移是一個多階段發展的生物學過程，需要多因素和多機制的參與，單一的瘤細胞檢出僅能提示增加了轉移風險，但不一定發生了腫瘤轉移，所以目前亟待有關結腸癌侵襲轉移的分子檢測，尤其是發現腫瘤特異性生物學標記物〔4〕。Wnt/βcatenin通路激活是結腸癌發生、發展過程中的重要環節〔2〕，有通過對Wnt/β－catenin信號通路相關因子與結腸癌患者預后關系的研究報道，提示了結腸癌組織中的MMP－7和Survivin表達是引發患者腫瘤性死亡的危險因素〔5〕，但有待進一步關于臨床腫瘤診斷和預后評估的研究。MMP－7屬于MMPs家族的重要成員，可激活多種細胞外基質，對細胞外基質有廣泛降解作用，可有效降解彈力纖維、纖維連接素、V型膠原纖維，抑制腫瘤轉移的跨膜蛋白，從而發揮破壞細胞外基質的作用〔6〕。MMP－7表達與人類多種惡性腫瘤的發生、發展相關，在結腸癌侵襲轉移過程中起重要作用，但其與患者病理參數及預后的關系相關報道結果并不一致〔7〕。有文獻報道，結腸癌組織中MMP－7基因高表達，可能與腫瘤惡性程度和侵襲能力相關〔8，9〕。最新研究提示了結腸癌可能通過MMP－7的降解作用促進腫瘤的侵襲轉移，而且可能與結腸癌的發生發展密切相關〔10〕。有研究通過免疫組化和原位雜交方法發現，MMP－7不在基質細胞中表達，良性腫瘤中的表達高于正常組織，但低于癌組織，提示了MMP－7可能參與了從正常組織向惡性組織轉化的過程〔11〕。本研究首先證實了結腸癌組織MMP－7表達明顯高于癌旁組織，進一步發現不同TNM分期結腸癌組織的表達呈隨分期進展逐漸增高的趨勢，提示MMP－7可能在結腸癌侵襲轉移和疾病進展過程中發揮了重要作用。

4參考文獻

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〔2015－03－15修回〕

(編輯郭菁)

〔中圖分類號〕R735. 35

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0365-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 051

第一作者:樊曉靜( 1974－)，男，副主任醫師，主要從事腫瘤外科研究。