腫瘤蛋白標志物分析技術研究進展

鄒　攀, 楊　鑫, 王　靜*, 張艷欣, 張　敏, 杜鵬飛

(1．哈爾濱工業大學化工學院，哈爾濱 150090 ；

2. 農業部農產品質量安全重點實驗室(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所)，北京 100081)

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腫瘤蛋白標志物分析技術研究進展

鄒攀1,2, 楊鑫1,2, 王靜1,2*, 張艷欣1,2, 張敏1,2, 杜鵬飛2

(1．哈爾濱工業大學化工學院，哈爾濱 150090 ；

2. 農業部農產品質量安全重點實驗室(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所)，北京 100081)

摘要：目前，我國的腫瘤發病率為285.91/10萬，平均每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤，因此腫瘤的早期診斷的重要性顯而易見。隨著分子生物學、免疫學診斷技術的飛速發展，尋找腫瘤診斷和預后的特異性標志物已成為近期研究的熱點。蛋白質是生命活動中多項功能的執行者，可以直接反映基因給予的信息。相比于基因，蛋白質的表達譜更可以直接地反映功能機制。針對蛋白質的生物特性，本文總結了目前臨床中篩查腫瘤蛋白標志物分析技術，如雙向凝膠電泳、基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜、表面增強激光解吸/電離-飛行時間質譜、蛋白質芯片技術，并對未來腫瘤蛋白標志物篩查提出新的展望。

關鍵詞：腫瘤；蛋白標志物；分析技術；研究進展

1引言

診斷惡性腫瘤的三大重要方法是腫瘤標志物檢測、影像學檢查及組織病理。腫瘤標志物可應用在對惡性腫瘤的診斷和隨訪，而且在鑒別診斷、療效評價、預后及檢測復發等領域也具有極其重要的作用[1]。腫瘤標志物(Tumor Marker，TM)是特征性存在于惡性腫瘤細胞或惡性腫瘤細胞異常產生的物質，正常細胞沒有或含量很低的特異性物質，或者宿主受腫瘤組織的刺激而產生的物質，與正常時或良性疾病相比，在質和量上存在顯著的差異[2]。

腫瘤標志物在聯合臨床和/或其他實驗室檢查中發揮著不可替代的預后價值，且其含量的波動有助于治療前病理學分型[3]。手術后，腫瘤及正常組織受到破壞，腫瘤標志物的含量會短期上升，其半衰期及殘留腫瘤細胞對其下降速度有重要影響。當對化療或放療效果進行評價時，腫瘤標志物含量發生大幅下降與有效的治療有關，而輕微下降或含量上升則通常提示疾病發展。由此可見，準確分析、確定腫瘤標記物，對腫瘤的篩查、診斷、預后及檢測療效等方面具有非同尋常的作用[4]。

當一個正常細胞轉變為腫瘤細胞時，蛋白質的表達會發生一些明顯變化，蛋白質組分析技術能夠從細胞水平上顯示出腫瘤變化過程中蛋白質的改變。本文總結了近年來用于腫瘤蛋白標志物研究的分析技術，以期為腫瘤蛋白標志物的分析研究提供一定的基礎。

2雙向凝膠電泳技術

雙向凝膠電泳(2-DE)是目前蛋白組學的三大支撐技術之一，另外兩個技術分別為蛋白質鑒定技術和生物信息學技術[5]。首先根據等電點不同，蛋白質在第一向等電聚焦電泳中得到分離，隨后轉移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據分子量大小進行分離。固相pH梯度等電聚焦技術的不斷發展和完善，雙向電泳的分辨率和重復率得到了大幅度提高。

雙向凝膠電泳技術上存在固有不足，如不能分辨低豐度的蛋白，不能分辨極酸和極堿性的蛋白，不能分辨分子量過高和過低的蛋白等[6]。但是雙向凝膠電泳具有良好的直觀性、實驗重復性高和方法成熟穩定等優點，目前仍然是蛋白組學研究的重要手段[7]。

鄭小華等人通過優化雙向電泳條件，確定了適合肝癌細胞HepG2的最佳雙向電泳條件，獲得了高分辨率、重復性好的2-DE圖譜，分離得到335個清晰的蛋白點，為進一步開展蛋白質組學研究提供有利前提[8]。

在雙向凝膠電泳的基礎上，發展出一種新型的分析手段，即熒光差異顯示雙向凝膠電泳(F-2D-DIGE)。等電聚焦前，首先用不同的熒光標記試劑標記等量樣品，混合樣品后進行雙向電泳，采用不同的波長對所得到的凝膠激發，可得到不同樣品結果，分析得到存在表達差異的蛋白質。本方法可以在同一塊凝膠上分析多種樣品，減輕工作量，降低實驗誤差，同時具有較寬的線性動態定量范圍。此外，如在凝膠中加入內標，可使不同凝膠中蛋白質豐度的比較更加準確[9,10]。

3基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜

基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)特別適合于蛋白等生物大分子的高通量篩選，還可以對寡核苷酸、基因的單核苷酸多態性進行分析；對天然與合成高分子的分子量和分子量分布進行分析。MALDI利用氮源脈沖激光使樣品從固相表面解吸，與此同時產生一系列不同質荷比的單價氣態離子，然后用TOF計量法測得離子通過相應檢測器所用時間從而獲得肽段的質量。

張瑋等人用MALDI-TOF結合激光捕獲顯微切割(LCM)技術確定卵巢癌外周血中趨化因子配體18蛋白(CCL18)升高的細胞來源。正常卵巢組織上皮細胞中未檢出CCL18表達，但是卵巢癌組織上皮細胞中CCL18蛋白表達量高，因此CCL18有可能成為新一代卵巢癌的腫瘤標志物[11]。通過聯合使用2-DE和MALDI-TOF-MS技術，孫明飛等[12]、宋大萍等[13,14]和Giribaldi[15]等，分別建立肺腺癌、宮頸癌和腎細胞癌的差異蛋白圖譜，確定了與腫瘤相關的蛋白質，為肺腺癌和宮頸癌腫瘤標志物研究奠定基礎。

MALDI-TOF多肽質譜指紋識別技術(PMF)是用于蛋白定量的一種最快速、成本低廉的方法。MALDI-TOF-MS和蛋白組學儀器的迅速發展使腫瘤標志物的快速識別成為可能，并能通過體液測定對腫瘤診斷和預后提供可靠信息[16,17]。越來越多的研究表明MALDI-TOF-MS技術不僅可用于定性分析，還有助于臨床分析中蛋白標記物的定量分析[18]。

MALDI-TOF有眾多優點，如分析速度快、樣品用量少、高靈敏度、操作簡便、試劑價格較低及質荷比檢測范圍廣等。但是有研究報道MALDI-TOF系統平行性和定量計算等方面的缺點。這是由于MALDI-TOF過度依賴于儀器的設置參數，如去除干擾離子的偏轉質量、用于峰定量的校準類型等[19]。MS數據含有大量噪音信號，這些噪音信號大多由儀器設置、電信號傳遞過程中產生的噪音等引起的。因此，在數據預處理過程中，需要減少噪音信號及系統偏差，包括校正基線、去噪音處理、信號峰校準等。此外，仍需更穩固的計算方法以降低未知的內在生物差異引起的變異影響[20,21]。

4表面增強激光解吸/電離-飛行時間質譜

目前，表面增強激光解吸/電離-飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS)廣泛用于分析體液的蛋白多肽譜，篩選潛在疾病相關蛋白質分子[22]。

蛋白質芯片陣列和質譜儀組成了SELDI-TOF-MS系統，根據蛋白質芯片的物質特性，可分為化學芯片和生物芯片兩類。通過疏水力、靜電力、共價鍵等結合樣本中的蛋白質的芯片為化學芯片；生物芯片則利用受體與配體、抗原與抗體、酶與底物等的相互作用捕獲樣本中的蛋白質[23]。由于SELDI-TOF-MS技術不依賴于蛋白質的構象，從而優于普通蛋白質芯片，因為它們需要設計與重組蛋白質結合的技術[24,25]。

該法利用激光脈沖輻射使分析物解吸形成荷電離子，然后根據不同質荷比的離子的飛行時間不同，從而得到質譜圖。通過軟件分析處理后，直接顯示樣品中蛋白質的種類及其分子量和含量等信息。若將軟件分析模擬譜圖與健康人群、某種疾病病人的譜圖比對分析，就能發掘該疾病相關的蛋白[26]。幾分鐘內就可完成整個測定分析過程，迅速且方法敏感，結果特異性高，并且不會破壞所測定的蛋白質。

SELDI-TOF-MS可不需處理血清、尿液、組織抽取物等直接進行點樣檢測[27]，使樣本與可溶的基質共結晶來產生質譜信號。在200 Da～500 kDa區間的樣品經SELDI-TOF-MS分析可得到清晰的質譜，每個樣本的分析時間僅為幾十分鐘，但是得到的信息量遠大于雙向凝膠電泳；只要與表面探針結合，就可以檢測到低豐度蛋白質，這也是雙向電泳不具備的特性[28]。SELDI-TOF-MS具有下列優勢：(1)對粗樣本直接分析處理，如血清、尿液等；(2)不僅可發現一種蛋白質或生物標記分子，而且還可以發現多種組合方式的蛋白質圖譜；(3)推動基因組學發展，基于蛋白質特點發現新的基因；(4)使大規模、超微量、高通量、全自動篩選蛋白質成為可能[29]。

徐文鴻等人采用SELDI-TOF-MS技術和CM10蛋白芯片，檢測76例大腸癌患者術前血清蛋白質指紋圖譜，篩選出的腫瘤標志物可以指導大腸癌的綜合治療，所建立的診斷模型可以輔助臨床明確大腸的術前分期[30]。相對于SELDI-TOF-MS在其他腫瘤中的成功應用，其在肺癌研究中沒有發揮該技術的優勢。目前研究很少考慮組織學類型對血清蛋白的影響，未能按國際肺癌分期標準進行實驗設計等原因，因此，SELDI-TOF-MS在肺癌研究中仍有待改進，以推動肺癌腫瘤標志物的研究[31]。

SELDI-TOF-MS的差異峰鑒定比較困難，主要是因為很難洗脫下結合在芯片上的蛋白質，并且結合的蛋白質含量很少，用現有的方法難以進行分析鑒定，只能得到差異多肽的分子量等信息[32]。此外，該技術不能進行后續鑒定，不能得出N-端、C-端序列和蛋白質的構型，仍需要與雙向電泳、生物信息學等技術聯合使用[33]。

5蛋白質芯片技術

蛋白質芯片(Protein Chip)技術是一種高通量、高靈敏度、高特異性的分析技術。它不僅是蛋白質組學研究中強有力的工具，也是臨床中疾病早期診斷、預后和治療效果評測新手段。

蛋白質芯片用未經標記或標記的生物分子與芯片上的探針進行反應，再通過特定的掃描裝置進行檢測、分析處理，是一種將多種蛋白質有序地固定于介質載體上的蛋白微陣列。蛋白質芯片技術的優勢有：(1)特異性強。相對于傳統的ELISA分析，蛋白質芯片采用光敏染料標記，靈敏度高； (2)樣品的前處理簡單，只需對少量標本進行沉降分離和標記后，即可進行分析和檢測；(3)效率極高。一次實驗可實現對多種目標蛋白進行同時檢測；(4)使用簡單，全自動化操作，結果正確率高；(5)重復性好，不同次實驗間相同兩點之間差異??； (6)適用于細胞系、組織和體液等多種生物樣品[34]。

于新宇采用12種腫瘤標志物蛋白芯片對12 574名健康體檢者及6 404名初次住院患者的血清進行檢測，發現C12多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統結果陽性者與臨床診斷符合率高達72.76%，為健康體檢、臨床腫瘤輔助診斷和高危人群早期腫瘤篩查提供新的方法[35]。王文濤采用納米金探針和蛋白芯片技術，建立了高靈敏度多腫瘤標志物檢測體系，確定的四種腫瘤標志物在蛋白芯片上無交叉反應和相互干擾，特異性良好，進而實現多種腫瘤標志物同時快速檢測，達到對肺癌早期診斷的目的[36]。伊力亞爾·努爾如拉等人選取40例腎透明細胞癌患者和53例同期健康志愿者及非腎癌患者，運用CM10弱陽離子交換蛋白芯片技術與SELDI-TOF-MS聯合檢測腎癌組及對照組血清差異蛋白，得到5種蛋白質，預測腎透明細胞癌的靈敏度為87.5%，為腎透明細胞癌的療效評價、預后評估及靶向治療有一定的參考價值[37]。

蛋白質芯片的制備及反應過程比基因芯片更復雜。無論是將蛋白質固定于載體上又要保持其生物活性，或是蛋白質的合成來說，都存在著技術難題。該方法主要依賴于抗體及其他大分子，但是規模生產存在很多問題，需要建立高通量蛋白表達和純化的方法。此外，需研制新載體及改進基質材料表面處理方法，以促使蛋白質特異性吸附到載體上[38]。隨著蛋白質芯片技術的日益完善，它必將會以其各大優點在蛋白質組學和其他領域發揮越來越大的作用，為腫瘤疾病的診斷提供更有利的技術支持。

6展望

上述方法都以其優勢在分析腫瘤蛋白標志物中發揮著重要作用，但其缺點影響了該技術的廣泛應用。蛋白質組學分析技術尚未發展出與基因分析中PCR擴增技術類似的技術使得低豐度蛋白質擴增，而由于高豐度蛋白質分子的掩蓋，低豐度蛋白質通常很難分離。另外，對極酸性、極堿性和難溶性蛋白質進行分離和鑒定很難，因此會丟失許多重要蛋白質的信息[39]。因此，在未來腫瘤標志物分析中，需要將各種分析手段聯合起來，取長補短，多種蛋白質組學技術聯合篩查腫瘤相關蛋白，這對探明腫瘤發生、發展的分子機理，提高臨床早期發現腫瘤具有重要意義。此外，還需進一步豐富和發展蛋白質組學研究技術，提高敏感性、穩定性、可重復性和特異性，以期獲取更準確的數據，發揮腫瘤標志物在腫瘤早期篩查、診斷、預后及治療效果的評價中的重要價值。

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Advance in analysis techniques of screening tumor protein marker

ZOU Pan1,2, YANG Xin1,2, WANG Jing1,2*, ZHANG Yanxin1,2, ZHANG Min1,2, DU Pengfei2

(1.SchoolofChemicalEngineering&Technology,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China;2.KeyLaboratoryofAgro-productQualityandSafety,InstituteofQualityStandard&TestingTechnologyforAgro-Product(MinistryofAgriculture,ChineseAcademyofAgriculturalSciences),Beijing100081,China)

Abstract：Nowadays, tumor incidence is high up to 285.91 in one hundred thousand, and six patients are diagnosed with malignant tumor every minute.Therefore, the early tumor diagnosis becomes more and more important. With the development of molecular biology and immune diagnosis technology, researchers pay more attention to specific marker screening for tumor diagnosis and prognosis. As the executant of many biological functions in vital movements, protein can reflect hereditary information directly, and protein expression profile is much clearer than gene expression profiling in reporting biological function mechanisms. According to the biological traits of protein, we summarized several techniques of tumor protein marker in clinical screening, including 2-D gel electrophoresis, matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass-spectrometry, surface enhanced laser desorption/ionization-time-of-flight-mass-spectrometry and protein chip. At last, we put forward expectations of tumor protein marker screening.

Keywords：Tumor; Protein marker; Analysis technology；Progress

中圖分類號：TQ937

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2016)01-026-05

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.05

作者簡介：鄒攀，女，博士研究生；研究方向：天然活性產物；E-mail：zoupan0601@163.com.*通信作者：王靜，女，教授，博士生導師；研究方向：天然活性產物；E-mail: w_jing2001@126.com.

基金項目：科技部農業科技成果轉化基金項目支持(資助號：No.2008GB23260349)；國家自然科學基金項目支持(資助號：No.31000831)。

收稿日期：2015-10-15;修回日期：2015-12-07.