流體剪切力調節血管內皮細胞自噬的研究進展*

張瑩瑩，曾燁，劉靜霞，閆志平，劉肖珩

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院生物醫學工程研究室，成都 610041)

1 引 言

血管內皮細胞是襯貼于血管內腔面的單層鱗狀細胞,在整個血管系統中發揮著重要的生理功能，對維持整個血管系統的正常運轉有重要作用。在血管內皮細胞中，自噬作為一種防御和應激調控機制，可以和溶酶體一起在細胞中作為“垃圾處理廠”發揮作用，降解體內衰老和受損的細胞，并將胞質內的部分蛋白質(包括受損和錯誤折疊的蛋白質、大分子、老化和機能障礙的細胞器以及蛋白質聚集物)消化分解為氨基酸用于供能和生物合成，為細胞的修復和再生提供原材料。自噬參與調節細胞物質的合成、降解和重新利用之間的代謝平衡，在機體的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病、神經退行性疾病等生理病理過程中發揮著重要的作用。最近有研究表明,細胞自噬的抑制可能是導致內皮細胞功能紊亂的重要機制[1]。流體剪切力也是影響血管內皮細胞形態和功能的重要因素之一，其對血管內皮細胞形態和功能的影響是許多疾病研究的重要切入點。血管內皮細胞在體內時時刻刻都受到血流剪切力的作用。

最新研究表明，自噬參與了剪切力介導的血管內穩態的維持，且流體剪切力能夠調節血管內皮細胞自噬的發生，有關其作用及機理的研究正在成為生命科學領域新的研究熱點。

2 血管內皮細胞生理功能

血管內皮細胞是血管腔面的一薄層扁平細胞，直接接觸血液，其主要的生理功能有：(1)屏障功能。血管內皮細胞是和血液直接接觸的一道天然屏障，由于內皮細胞具有獨特的結構和代謝特性，能選擇性的調節小分子至超大分子物質通過血管壁，減少血管通透性，調節組織與血液的物質交換，防止血漿成分和血液細胞無序地侵入[2]。(2)分泌功能。血管內皮細胞可以通過膜受體感知血流動力學和血源性信號的變化,合成并分泌多種生物活性物質來調節血管張力、維持血管壁的完整性并維持血液的正常流動狀態。其中有血管舒張因子，如一氧化氮、前列環素等；血管收縮因子，如內皮素-1等；促凝因子，如組織因子等；抗凝因子，如一氧化氮、肝素等；以及其他血管活性因子，如白細胞介素、硫酸乙酰肝素等。正常生理狀態下，舒張血管與收縮血管作用、促凝與抗凝作用保持動態平衡，使血液不致發生凝固而形成血栓。當機體血管內有血栓(包括微血栓)形成時，其溶解纖維蛋白系統則被激活，溶解和去除血栓中的纖維蛋白。(3)參與血管生成。在血管形成因素的刺激下，內皮細胞能分泌內皮細胞生長因子(VEGF)、胰島素生長因子-1(IGF-1)、血小板衍生生長因子(PDGF)等形成完整血管所必需的生長因子。這種參與血管生成的功能，在一些生理狀態如子宮內膜增厚和病理狀態如腫瘤等都有體現。

3 自噬對血管內皮細胞功能的影響

自噬是一種應激狀態下大分子物質和細胞器的降解及再循環的過程[3-4]，可以在多種應激狀態下被激活，比如饑餓、氧化、線粒體DNA損傷以及炎癥[5-6]。雖然過度的自噬會導致細胞死亡，但在正常情況下，細胞自噬被認為是一種細胞自我保護和適應性的機制[7]。

目前研究表明，細胞自噬和血管生成之間存在著某種負反饋的關系，血管內皮細胞自噬可能是其發揮抗血管生成作用的一種機制。血管生成是指從已存在的血管床中產生出新生血管系統, 是一個包括血管內皮細胞增殖、遷移及胞外基質降解的多步驟復雜過程[8]。腫瘤血管生成是所有實體腫瘤的共同特征，是實體腫瘤生長和轉移必須依賴的病理學基礎，與腫瘤的生長、侵襲轉移關系極為密切。抗血管生成作用在惡性腫瘤的預防和治療方面具有重要的意義。人類纖溶酶原(Kringle 5,K5)和內皮抑素(endostatin，ES)是有效的血管生成抑制劑，這些抑制劑通過各種細胞內信號通路誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖[9-10]。有研究表明[11]，K5和ES除了能誘導細胞凋亡外，還可以促進血管內皮細胞的自噬。Nguyen[12]等的研究也顯示，K5可以誘導血管內皮細胞發生特異性自噬，并且這種自噬在沒有營養應激的情況下也可以被引發。他們認為，K5與內皮細胞表面的葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulatedprotein-78, GRP-78)結合，而GRP-78與缺氧及內質網應激反應有著密切的關系，進而影響Beclin 1表達，K5就是通過使Beclin 1表達增加來調節內皮細胞自噬，如果延長K5的處理時間，最終會通過血管內皮細胞線粒體膜去極化和胱天蛋白酶的活化而導致細胞凋亡，因此，發揮抗血管生成作用。這些結果提示，K5可以引起內皮細胞發生自噬并產生抗血管生成作用，抗血管生成作用的產生可能與細胞自噬有關。Nguyen[13]等也曾在研究中用ES成功誘導自噬。Maes等[14]在研究中表明自噬基因缺失的小鼠在做了腫瘤感染的處理后，由于血管生成,自噬基因缺失的小鼠比未做基因缺失的小鼠更能誘導一些腫瘤的發生。AKT3信號通路是血管生成過程的關鍵信號通路[15]，Corum等[16]在研究中發現小鼠AKT3基因敲除可以誘導發生細胞自噬。這些結果都提示，內皮細胞自噬可能參與了抗血管生成作用。

自噬與NO的調節也有很大關系。NOS/NO系統在多種心血管疾病的發生發展中發揮著重要的作用，血管內皮細胞釋放的NO能抑制血小板聚集及白細胞黏附在血管壁,抑制血管平滑肌增生,抑制單核巨噬細胞浸潤,從而抑制動脈粥樣硬化的發生和發展[17]。Bharath等[18]的研究表明在剪切力的作用下，被敲除自噬基因的內皮細胞內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的磷酸化增加，NO的產生明顯被抑制，同時自噬的抑制使內皮細胞活性氧和一些細胞炎性因子的產生增加。可見，自噬參與了剪切力介導的血管內穩態的維持。細胞自噬的缺失很可能是導致內皮細胞功能紊亂的重要機制，而且自噬的發生加強了內皮細胞對其正常功能的維護[1]。此外，大多數動脈粥樣硬化斑塊都呈現出自噬的標志物，并且伴隨著動脈粥樣硬化的發展，自噬功能逐漸紊亂[19]。

4 流體剪切力對血管內皮細胞的影響

4.1 流體剪切力對血管內皮細胞功能的影響

在正常的血液系統中，血管內皮細胞無時無刻不受血流作用力的影響。血流作用力主要有三種，分別是靜水壓力、周向拉伸應力和流體剪切力。其中流體剪切力在調節內皮細胞功能有重要作用。有研究表明[20]，流體剪切力作用于內皮細胞表面G蛋白可觸發內皮細胞內的一些磷酸化過程，導致血管內皮細胞沿血流方向發生重排，同時調控核因子kB介導的信號轉導通路，進而調節內皮細胞多種基因如編碼生長因子、粘附因子、血管活性物質、凝血因子和趨化因子等的基因表達。血液是一種粘性流體,由于粘性的存在,在管道中流動的流體出現了分層流動，各層流體只做相對滑動而彼此不相混合，這種現象稱為層流。層流能夠促進內皮細胞的存活，使內皮細胞按照血流方向排列，并促進血管舒張物質和抗凝物質的分泌[21],同時層流能夠使內皮細胞自噬的表達上調[1]。

流體剪切力也能夠影響血管內皮細胞遷移并刺激血管生成，在血管生成過程中發揮重要作用[22]。流體剪切力作用下，血管內皮細胞的微脈管系統生長加快[23]，這種結果可能和流體剪切力能使血管內皮細胞釋放NO有關。NO是在血管內皮細胞的血管生成過程中起關鍵作用的一種信號分子[24]，流體剪切力能夠激活一氧化氮合酶刺激血管內皮細胞產生NO,而NO的產生促進了內皮小管的形成[25]。

4.2 流體剪切力對血管內皮細胞自噬的調節

細胞自噬和流體剪切力都能夠影響血管內皮細胞的功能，都是維持血管內皮細胞正常生理功能的重要因素，都是研究相關疾病的重要切入點。近年來，一些研究者開始關注這兩種因素之間的相互作用。2011年King[26]等在自己的研究中提出機械應力可以誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231發生自噬，之后Chen等[27]在2012年提出流體剪切力的加載可以抑制人臍靜脈內皮細胞上雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達，而且microRNA-101(miR-101)在這個過程中發揮著重要的作用。mTOR是氨基酸、ATP和激素的感受器，它在調節細胞生長和自噬的發生過程有重要作用。mTOR可以抑制自噬上游Atg1/Ulk復合物[28]，激活mTOR可以抑制細胞自噬的發生，抑制mTOR能誘導細胞自噬的發生[29]。人臍靜脈內皮細胞加載12 dyn/cm2的剪切力12 h后，miR-101的表達明顯上調；miR-101模擬物(mimics)使包含mTOR質粒的熒光酶素降低，內皮細胞的mTOR表達降低,使細胞周期停滯于G1期，從而抑制了內皮細胞的增殖；miR-101抑制劑(inhibitor)則使流體剪切力對mTOR表達的抑制作用減弱。通過這項研究，研究者們認為流體剪切力和細胞自噬之間也應存在著某種關系。之后，JUAN等人[1]在研究中證實了流體剪切力與細胞自噬之間的關系。他們用體外灌流系統分別對經過自噬激動劑和抑制劑處理過的人臍靜脈內皮細胞及家兔動脈進行流體剪切力的加載，檢測內皮細胞自噬的表達，結果發現流體剪切力可以促進內皮細胞發生自噬。剪切力和自噬激動劑的同時作用，加強了內皮細胞自噬。

最近，Ding等人[30]在研究中發現LOX-1在流體剪切力調節內皮細胞自噬的過程中扮演者非常重要的角色，并且低剪切力相對于高剪切力來說對內皮細胞自噬的調節作用更加明顯。LOX-1是內皮細胞對氧化性低密度脂蛋白的一個重要受體，LOX-1在細胞多種病理生理過程中多發揮著重要的作用，包括內皮細胞增殖、凋亡、活性氧自由基的產生以及炎癥[31-35]。LOX-1的表達與內皮細胞自噬有關[36]，流體剪應力也在LOX-1的表達中發揮著重要的作用[33]。他們在實驗中分別用3、15、30 dyn/cm2的流體剪切力通過體外灌流系統來誘導內皮細胞自噬，結果表明3 dyn/cm2大小的低剪切力可以明顯誘導內皮細胞自噬的發生，而隨著流體剪切力的變大，對內皮細胞自噬的誘導逐漸被抑制。他們還分別檢測了小鼠主動脈分叉處、主動脈弓處、胸動脈和髂動脈處的內皮細胞自噬的發生及LOX-1的表達，結果表明主動脈分叉處的內皮細胞自噬和LOX-1的表達明顯高于主動脈弓處、胸動脈和髂動脈處，造成這種變化的原因也是主動脈分叉處血液的流體剪切力較低。他們還用炎性因子LPS刺激內皮細胞后檢測自噬的表達，結果表明炎癥狀態下內皮細胞自噬和LOX-1的表達明顯增強，其中LOX-1基因敲除的小鼠自噬表達降低，而LOX-1超表達的小鼠的內皮細胞自噬的表達明顯升高。以上結果表明，低剪切力對內皮細胞自噬有非常重要的調節作用，而且與炎癥環境下的血管內皮細胞功能變化密切相關。

目前，對于流體剪切力是否通過mTOR調節細胞自噬，有研究者提出了不同看法。Liu等[37]利用12或20 dyn/cm2的層流剪切力(Flexcell streamer平行平板流動腔)作用人臍靜脈內皮細胞，并沒有發現mTOR的磷酸化水平有顯著性變化，但是他們發現組蛋白脫乙酰酶Sirt1(Sirtuin type 1)參與剪切力對細胞自噬的調控，Sirt1基因的抑制使剪切力介導的自噬發生減少，而超表達則促進了這種自噬的發生。已有研究表明，Sirt1可直接通過調控自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)如ATG5、ATG7、ATG8的表達參與細胞自噬的調節[38]?？梢姡黧w剪切力對細胞自噬的調節機制較為復雜，目前并不完全清楚。

5 展望

綜上所述，流體剪切力可調節血管內皮細胞的功能，如受體基因表達、細胞因子分泌、遷移等促進血管生成。而內皮細胞自噬則參與了抗血管生成的過程?？梢姡黧w剪切力和內皮細胞自噬對血管生成的調節作用存在一個有效平衡。而研究又表明流體剪切力對內皮細胞自噬存在調節作用，那么，研究者推測流體剪切力是調控上述平衡的關鍵因素。對于流體剪切力的具體調節作用及相關分子機制的研究仍處于起步階段，深入地進行這些研究可以為我們研究血管生成機制提供新的切入點，而相關成果也將有助于我們好的預防和治療相關癌癥以及心血管疾病。