芽孢桿菌產環脂肽類化合物結構與生物合成機制研究進展

鄭 維， 權春善，趙 晶， 許永斌

(大連民族大學 生命科學學院 國家民委教育部重點實驗室， 遼寧 大連 116600)

芽孢桿菌產環脂肽類化合物結構與生物合成機制研究進展

鄭 維， 權春善*，趙 晶， 許永斌

(大連民族大學 生命科學學院 國家民委教育部重點實驗室， 遼寧 大連 116600)

芽孢桿菌產環脂肽類化合物結構多樣，具有較強的抗菌活性，在農業和食品等應用廣泛。近年來發現部分環脂肽具有拮抗人體病原菌及抗腫瘤等的藥用價值。本文對芽孢桿菌產環脂肽類化合物的生物功能、結構和生物合成機制的研究進展做一總結。

環脂肽 ； 芽孢桿菌； 結構 ；生物合成

芽孢桿菌屬(Bacillus)革蘭氏陽性桿菌，在自然界分布廣泛，可以分泌多種環脂肽類化合物。其中部分環脂肽類物質具有較好的抗菌活性物質，比如表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和豐源素(fengycin)等)[1]。這些環脂肽類化合物主要由肽段和脂肪酸鏈組成環狀結構，在芽孢桿菌內通過非核糖體途徑合成，作為次級代謝產物排出菌體體外。這類物質分子量較低，現有研究表明，環脂肽類物質主要具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物學功能。本文主要對芽孢桿菌產生的肽類抗生素的生物活性、結構以及及其生物合成研究成果進行了綜述，同時對這些肽類抗生素的生產及開發進行展望。

1 環脂肽的生物學功能

芽孢桿菌所產生的不同化學結構的環脂肽具有多樣化的功能。以往的研究結果集中于環脂肽在拮抗植物病原菌中所具有的重要作用。近年來，科學家在環脂肽研究的相關工作中發現，一些芽孢桿菌產生的環脂肽類物質具有抗人體病原菌和抗腫瘤等作用[2-4]。來源于Bacillus velezensis H3的Surfactin異構體可以抑制金黃色葡萄球菌、分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌等病原菌[5]。從枯草芽孢桿菌SSE4的培養液中分離到一種新的脂肽類抗生素subtulene A，可以有效拮抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，其中包括人類病原體如嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，其中陰溝腸桿菌是院內感染的嚴重的耐藥病原體[6]。稀有海洋芽孢桿菌菌株產生的Fengycin異構體的活性物質可以有效抑制微球菌、大腸桿菌、枸櫞酸桿菌，糞腸球菌和粘質沙雷氏菌等[7]。從內生解淀粉芽孢桿菌ES-2培養液中分離得到的Fengycin和Surfactin脂肽具有強烈抑制革蘭氏陽性細菌生長以及除了人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropic)外所有的革蘭氏陰性細菌[8]。伊枯草菌素和豐源素的在抗植物病原真菌中顯示了良好的活性[9]。因為環脂肽的表面活性劑效果，脂肽表面活性劑可誘導人紅細胞溶血，可以使用脂肽表面活性劑作為纖維蛋白凝塊形成的強效抑制劑。Bernheimer和Avigad證明由枯草芽孢桿菌來源的枯草溶菌素具有可以使纖維蛋白形成凝塊，并抑制作用紅細胞溶血等作用[10]。Arima等人首次探討了表面活性劑是通過抑制纖維蛋白單體轉化為纖維蛋白聚合物纖維蛋白凝塊形成抑制劑[11]。Aranda等學者研究了抗菌脂肽Iturin的有效溶血活性，得到了使人體紅細胞溶血的伊枯草菌素最低劑量濃度[12]。近些年來也有研究表明，環脂肽類物質同樣具有抗腫瘤活性。Hajare S N等人從解淀粉芽孢桿菌菌株的次級代謝產物中分離出了一種環脂肽，經過研究發現，對肺腺癌細胞，腎癌細胞和結腸腺癌細胞3種癌細胞具有不同程度的殺傷作用。

2 肽類抗生素的結構特征

芽孢桿菌同一株菌可以同時產生多種環脂肽的異構體。環脂肽的合成包括含親水的肽鍵的多肽部分和親油的脂肪烴鏈兩部分組成。表面活性素Surfactins、伊枯草菌素(Iiturin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、桿菌抗霉素(Bacillomycin)、Bacillopeptins結構中的脂肪酸鏈直接參與肽環形成的化合物，豐原素 (Fengycin)和制磷脂素(Plipastatin)的脂肪酸鏈不參與肽環形成。芽孢桿菌產生的各種脂肽化合物異構體取決于多肽的氨基酸殘基序列和環化方式的不同，以及脂肪酸鏈的長度和結構區別等因素。肽段大約是由十肽環構成，同時還帶有一個氨基酸尾鏈，肽段中的氨基酸通常由必須氨基酸或非必須氨基酸組成，其中非必須氨基酸中包括D型氨基酸和羥基氨基酸或N-甲基氨基酸。因此，非核糖體多肽結構多樣化，也具有了重要的生物活性[13]。

3 多肽抗生素的生物合成

微生物產生的環脂肽化學結構比較豐富。在過去的十年間，研究人員對于環脂肽的生物合成機制和基因調控系統進行了廣泛的研究。環脂肽是由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)復合體以非核糖體多肽的方式催化合成。NRPSs是多模塊酶識別，每個模塊允許在一個特定的肽部分氨基酸的摻入，從而激活，修飾和鏈接氨基酸中間體到產生的肽[13-14]。典型的模塊域包括以下四個部分：腺苷化結構域(amino acid activating domain, A)、巰基化功能域 (T)、縮合功能域 (condensation domain, C)和硫酯酶結構域(thioesterase domain, TE)。此外還有一些非核糖體肽合酶上還包括環化域(cyclization domain, Cy)、甲基轉移酶域(methyltransferase domain, MT)、差向異構化域(epimerization domain, Er)等。合成酶在模塊上有效分步，其上的每個模塊依次將相應氨基酸組合到多肽鏈中。所以非核糖體多肽化合物的結構多樣化往往伴隨著重要的生物學活性[13]。

3.1 肽段的生物合成

多肽部分是由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)復合體以非核糖體多肽的方式合成[13]。合成酶在模塊上有效分步，其上的每個模塊依次將相應氨基酸組合到多肽鏈中[13]。

多肽合成的過程如下：具有氨基酸激活功能的A結構域從底物中選擇結合特定的氨基酸，由底物氨基酸的腺苷酸反應激活轉化為氨酰腺苷酸。然后氨酰酰苷酸與T結構域的磷酸泛酰巰基輔基的巰基以共價方式結合形成硫酯鍵，組成后的氨酰-S-載體復合體上的氨基與C結構域的肽酰基的酰基進行親核反應，形成新肽鍵。從而延長了一個氨基酸的肽酰載體復合物進入下一個肽酰形成的反應。最終，在完成肽鏈的延伸后，TE域終止合成肽鏈，將肽鏈釋放下來，并進行環化。

3.2 脂質體部分的生物合成

脂肽脂質部分的生物合成是由數個模塊耦合來完成，對肽鏈的脂肪酸鍵進行活化。Duitman等學者將其歸納為五個步驟[15]，首先，域的酰基輔酶A連接酶(Al)耦合的輔酶A脂肪酸。活性脂肪酸后，轉移到第一個域的酰基載體蛋白輔因子4-phosphopantethein(ACP)。同時，一個丙二酰輔酶A固定到ACP2域。丙二酰基硫酯的催化酮的縮合(KS)合成酶結構域導致一酮酯的形成。酮酯轉化為氨基酸的轉氨基脂肪酸。氨基脂肪酸可以通過縮合結構域轉移到硫醚化域。它可以連接到一個氨基轉移酶的固定肽部分的氨基酸生物合成的第一個模塊。最終實現合成、脂肽可修改特定酶的糖基化或鹵化的合成酶相關。

4 展望

近年來全基因組測序技術的快速發展，芽孢桿菌全基因組測序逐漸完成，隨著已知和潛在的功能基因得以發現。采用基因敲除、基因隨機突變和定位突變等方法，對突變菌株進行篩選，相關基因被克隆、分析，脂肽類抗生素合成途徑和調控方式已經解明。利用合成生物學和組合生物學的理論和方法對芽孢桿菌產生的脂肽類物質進行分析和表達，為發現更多潛在的天然新型環脂肽類化合物的發現打開了嶄新的局面，從而更加提高了芽孢桿菌在工業上的應用范圍。

[1] Pathak K V, Keharia H. Identification of surfactins and iturins produced by potent fungal antagonist,Bacillus subtilis K1 isolated from aerial roots of banyan (Ficus benghalensis) tree using mass spectrometry[J]. Biotechnology, 2013: 4(3):1-13.

[2] Ohno A, Ano T, Shoda M. Use of soybean curd residue, okara, for the solid state substrate in the production of a lipopeptide antibiotic, iturin a, by Bacillus subtilis NB22[J].Process Biochem 31, 1996, 31(8):801-806.

[3] Fernandes , Vicentearruda P A， Desantos I R,et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria[J].Braz J Microbiol, 2007, 38(4):704-709.

[4] Haddad N I. Isolation and characterization of a biosurfactant producing strain, Brevibacilis brevis HOB1[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35(12):1597-1604.

[5] Liu X, Ren B, Chen M, et al. Production and characterization of a group of bioemulsifiers from the marine Bacillus velezensis strain H3[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(5): 1881-1893.

[6] Williams B H, Hathout Y, Fenselau C. Structural characterization of lipopeptide biomarkers isolated from Bacillus globigii[J].J Mass Spectrom, 2002, 37(3):259-264.

[7] Sivapathasekaran C, Mukherjee S, Samanta R, et al.High-performance liquid chromatography purification of biosurfactant isoforms produced by a marine bacterium[J].Anal Bioanal Chem,2009, 395(3):845-854.

[8] Sun L, Lu Z, Bie X, et al. Isolation and characterization of a co-producer of fengycins and surfactins, endophytic bacillus amyloliquefaciens ES-2, from scutellaria baicalensis georgi[J].World J Microbiol Biotechnol, 2006, 22(22):1259-1266.

[9] Snook M, Mitchell T, Hinton D M, et al. Isolation and characterization of leu7-surfactin from the endophytic bacterium Bacillus mojavensis RRC 101, a biocontrol agent for Fusarium verticillioides[J]. J Agric Food Chem,2009, 57(10): 4287-4292.

[10] Bernheimer A W, Avigad L S. Nature and properties of a cytolytic agent produced by Bacillus subtilis[J].J Gen Microbiol, 1970 (6): 361-366.

[11] Arima K, Kakinuma A, Tamura G. Surfactin, a crystalline peptide lipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibitor of fibrin formation, Biochem. Biophys[J]. Res Commun, 1968, 31(3):488-494.

[12] Aranda F J, Teruel J A, Ortiz A. Further aspects on the hemolytic activity of the antibiotic lipopeptide iturin A, Biochim. Biophys[J]. Acta, 2005, 1713(1):51-56.

[13] Roongsawang N, Washio K, Morikawa M. Diversity of non ribosomal peptide synthetases involved in the biosynthesis of lipopeptide biosurfactants[J].Int J Mol Sci,2010, 12(1): 141-172.

[14] Koglin A, Walsh C T.Structural insights into nonribosomal peptide enzymatic assembly lines[J]. Nat Prod Rep 2009, 26(8): 987-1000.

[15] Marahiel M A, Strchelhaus T, Mootz H D. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis[J]. Chemical reviews, 1997, 97(7): 2651-2674.

(本文文獻格式：鄭 維， 權春善，趙 晶，等.芽孢桿菌產環脂肽類化合物結構與生物合成機制研究進展[J].山東化工，2016，45(08)：51-52，54.)

Research Progress on the Structure and Biosynthetic Mechanism of Lipopeptides by Bacillus

Zheng Wei, Quan Chunshan*, Zhao Jing, Xu Yongbin

(College of Life Science, Key Laboratory of the State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

Lipopeptides which are produced by Bacillus showed structure various, and strong antibacterial activity in the agriculture and food is widely used in many fields. Lipopeptide have been proven that they had bioactivities, such as antibacterial, antithrombin and antitumor, etc. in recent years. This paper reviewed the research progress in structure and biosynthetic of the lipopeptides which are produced by Bacillus.

lipopeptide; Bacillus; structure; biosynthesis

2016-03-07

中央高校基本科研業務費( DC13010312)

鄭 維(1978—)，女，遼寧大連人， 工程師，碩士， 研究方向: 微生物；通訊作者: 權春善( 1973—)，女，黑龍江佳木斯人，大連民族大學 生命科學學院教授，博士．研究方向: 微生物。

Q936；S476

A

1008-021X(2016)08-0051-02