辣椒胞質雄性不育及其育性恢復研究進展

魏兵強張淼王蘭蘭陳靈芝張茹侯棟張建農

（1. 甘肅省農業科學院蔬菜研究所，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學園藝學院，蘭州 730070；3.蘭州城市學院，蘭州 730070）

辣椒胞質雄性不育及其育性恢復研究進展

魏兵強1，2張淼3王蘭蘭1陳靈芝1張茹1侯棟1張建農2

（1. 甘肅省農業科學院蔬菜研究所，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學園藝學院，蘭州 730070；3.蘭州城市學院，蘭州 730070）

利用植物胞質雄性不育系生產雜交種子，不僅無需人工去雄，還能降低制種成本、確保雜交種子純度，是植物雜種優勢利用的重要途徑。簡要綜述了辣椒雄性的敗育時期、能量代謝、物質差異、激素變化，并分別從遺傳分析、QTL定位和分子生物學等方面綜述了辣椒胞質雄性不育及其育性恢復的機理。

辣椒；胞質雄性不育；育性恢復

植物胞質雄性（cytoplasmic male sterility，CMS），即核-質互作雄性不育，是指由于雄蕊退化、花粉敗育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉的一種母性遺傳現象，廣泛存在于高等植物中，由Jones于1944年首次在洋蔥中發現［1］。植物胞質雄性不育由細胞質不育基因（S-）和細胞核不育基因（rfrf）共同控制，但核內恢復基因（Rf）能夠抑制不育基因（S-）的表達，從而使育性恢復。在農業制種過程中，利用胞質雄性不育生產雜交種子，不但可以省去人工去雄，降低制種成本，還能確保雜交種子純度，是植物雜種優勢利用的重要途徑［2-4］。

辣椒是重要的蔬菜作物，雜種優勢非常明顯。1958年，Peterson［5］首次報道了辣椒核質互作型雄性不育，從此辣椒雄性不育的研究和利用得到了廣泛重視。為了探明辣椒胞質雄性不育機理，加速胞質雄性不育在辣椒上的應用，前人進行了大量研究，本文分別從細胞學、生理生化和分子生物學3個方面對辣椒胞質雄性不育研究進展進行綜述。

1 辣椒胞質雄性不育的細胞學研究進展

雄性不育的細胞學研究目的在于闡明其敗育時期、方式及絨氈層變化的關系等。一些研究結果認為敗育發生在四分體小孢子形成之前，由于絨氈層細胞的過度膨大，嚴重擠壓花粉母細胞，使得減數分裂不能正常進行，未能形成正常的花粉粒而敗育［6-10］。何長征等［11］認為在四分體形成之前，絨氈層解體，并與花粉母細胞黏在一起，導致無法進行正常的減數分裂，最終導致敗育。而另一些研究則表明敗育發生在四分體時期，極度膨脹的絨氈層細胞擠壓四分體使其解體，無可育花粉形成，且部分不育系的染色體出現了異常［12-16］。李瑩瑩等［17］認為敗育在任何時期都有發生，而且敗育方式多種多樣，主要表現為絨氈層的異常發育。因此，敗育的時期和方式因辣椒材料的不同而不同，但比較一致的看法是敗育發生在四分體時期前后。

2 辣椒胞質雄性不育的生理生化研究進展

植物育性是由基因控制的一系列生理生化反應與環境作用的結果。雄性不育的生理生化研究涉及小孢子發育過程中的能量代謝、物質代謝和內源激素等途徑和物質在不育系和保持系之間的對比變化。

2.1 能量代謝

能量代謝是花粉發育的能量來源，其代謝平衡與否與植物育性密切相關。不育系和保持系在呼吸速率、呼吸酶、ATP及呼吸途徑方面都有明顯差別。前人研究表明，雄性不育系與正常可育植株相比，呼吸代謝異常，不育系花藥的呼吸速率低于可育植株花藥［18，19］。抗氰呼吸是研究雄性不育發生的生理生化機理的重要方面，鄧明華等［20］發現不育系花蕾中抗氰呼吸強度弱于保持系。

2.2 物質代謝

植物花粉發育需要積累淀粉、氨基酸等營養物質，一方面作為花粉發育的營養物質；另一方面也可作為信號物質影響花粉發育。特別是游離脯氨酸，它是氨基酸的一種儲存形式，能夠轉化成其他形式的氨基酸。前人研究表明不育系花蕾中的游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量和CAT（過氧化氫酶）酶活性明顯低于保持系，而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）酶活性高于保持系［21-24］。

2.3 內源激素

植物激素是植物生命體代謝活動的產物，在植物生長發育的各個階段，植物激素起著重要調節作用。大量研究表明，植物雄性不育系與保持系生殖器官中內源激素含量明顯不同，不育系花藥中IAA（生長素）和ETK（細胞分裂素）的含量與保持系相比明顯偏低，而ABA（脫落酸）的含量卻高于保持系［25-27］。

3 辣椒胞質雄性不育及其育性恢復的分子生物學研究進展

3.1 辣椒胞質雄性不育的分子生物學研究進展

CMS發生的分子機理研究以及雄性不育相關基因的研究主要集中在線粒體基因上。研究表明，CMS 的發生與由線粒體基因的重組而產生的嵌合開放閱讀框有很大關系［28，29］。盡管這些開放閱讀框翻譯產物的作用機理尚不明確，但是造成 ATPase 功能紊亂、線粒體膜結構破壞及絨氈層細胞程序化死亡被認為是比較可能的作用機理［30，31］。Kim等［32，33］克隆得到與紅辣椒胞質雄性不育基因相關的線粒體開放閱讀框atp6-2和orf456，定位于coxⅡ基因的3'端；Gulyas等［34］在orf456的基礎上，利用RT-PCR技術，發現了一個新的開放閱讀框orf507，終止密碼子在原始orf456下游49個核苷酸處，可能與花粉小孢子的形成有關。

此外，一些與不育基因連鎖的分子標記也被陸續報道。Kim等［35］開發出與不育基因相關的標記coxⅡ SCAR和atp6 SCAR。Jo 等［36］設計了一個新的雄性不育相關標記accD-U。魏兵強等［37］篩選得到與CMS不育基因連鎖的 BH19-S900標記，并將其轉化為共顯性的 SCAR 標記。這些標記為不育系的分子標記輔助育種奠定了基礎。

3.2 辣椒胞質雄性不育育性恢復的遺傳和分子生物學研究進展

關于辣椒胞質雄性不育恢復性的遺傳，前人已做過許多研究。Peterson［5］認為，辣椒胞質雄性不育育性恢復受一對主效基因控制，但許多研究表明其并非由一對主效基因所控制。Novak等［38］的研究表明恢復性受兩對互補基因控制，而Wang等［39］則認為辣椒胞質雄性不育恢復性表現為數量性狀遺傳特點，且受兩對主效基因和一些微效基因控制。另外，低溫能使育性暫時性恢復，表明溫度能夠影響部分育性修飾基因的表達［40］。魏兵強等［41］利用植物數量性狀主基因+多基因混合遺傳分析方法得出辣椒胞質雄性不育恢復性受兩對加性—顯性上位性主基因+加性—顯性多基因控制，主基因表現出較高的遺傳率。綜上表明，關于對辣椒胞質雄性不育恢復性的遺傳比較一致的看法是受一或二對主基因控制，輔以微效多基因修飾。

細胞核內Rf（retorer of fertility）基因，能夠抑制胞質不育基因（S-）的表達，從而使CMS育性恢復。目前，在其他作物上已克隆了部分恢復基因，如玉米Rf2基因、矮牽牛Rf基因、蘿卜Rfo基因和水稻Rf-1基因等［42-46］。除玉米Rf2是核編碼線粒體定位的乙醛酸脫氫酶（aldehyde dehydrogenaes，ALDH）基因，大部分Rf基因的編碼蛋白都含有PPR（pentatricopeptide repeat），它以 35 個氨基酸為重復單位重疊形成超螺旋結構，與RNA結合在一起［47］。Hu等［48］克隆出兩對恢復基因Rf5和Rf6，進一步研究發現Rf5是一 個PPR家族的基因，它需要結合另外一個GRP基因形成恢復基因分子復合體（restoration of fertility complex，RFC），并在線粒體內完成對不育基因 RNA 的剪切，原本長度為 2 kb 的不育基因 RNA 被剪切成 1.5 kb 和0.5 kb的兩條 RNA后，阻斷不育蛋白翻譯，使育性恢復。

而關于辣椒Rf基因的研究僅有部分分子標記方面的研究。Zhang等［49］獲得了與辣椒胞質雄性不育恢復基因連鎖的兩個RAPD標記OW19800和OP131400，Min等［50］利用染色體步移技術獲得了一段約10 kb的OP131400側翼序列。但之后的研究表明，OW19800和OP131400并不一定出現在恢復系中，因為標記與恢復基因間仍存在一定的遺傳距離［51］。同時，Kim等［52］報道了一個與恢復基因連鎖的CAPS標記AFRF8CAPS，Gulyas等［53］報道了一個與恢復基因連鎖的STS標記CRF-SCAR，Lee等［54，55］報道了一個與部分恢復性連鎖的CAPS標記PR-CAPS，郭爽等［56］利用抑制消減雜交技術分離到辣椒恢復性相關EST。Wang 等［57］對辣椒的 Rf 基因進行 QTL 定位，共定位到1個主效基因和4個微效基因。盡管這些標記在一些恢復系的篩選中起到了重要作用，但也有研究表明這些標記在部分不育系和恢復系間并無多態性，因此，這些標記在實際應用中仍存在著材料的局限性，開發更為高效和通用的分子標記或基因標記是當務之急［58］。

4 結語

關于辣椒胞質雄性不育的相關研究，前人分別從雄性敗育時期、能量代謝、物質差異、激素變化，以及遺傳和QTL分析、分子標記和基因克隆等方面進行了相關研究，對于深入理解辣椒胞質雄性不育及其育性恢復機理，加速CMS在育種上的應用具有重要意義。但由于辣椒CMS受細胞質基因和細胞核基因共同控制，其調控機理仍較復雜，將來應著重加強以下兩個方面的研究：一是細胞核內可能存在多個恢復位點，因此應重點加強育性恢復基因的定位與克隆，進而研究核質互作機理；二是育性恢復受環境影響，應開展環境對育性變化的調控研究，特別是溫度調節育性開關機理研究。另外，辣椒基因組測序的完成，有助于我們從更深層次探索辣椒胞質雄性不育及其育性恢復的分子機理［59，60］。

［1］趙軍良, 梁愛華. 高等植物細胞質雄性不育分子機理的研究進展［J］. 西北植物學報, 2004, 24（8）：1543-1546.

［2］鄒學校, 馬艷青, 戴雄澤, 等. 辣椒胞質雄性不育雜交種規模制種技術［J］. 中國蔬菜, 2008, （5）：45-47.

［3］陳斌, 耿三省, 張曉芬. 辣椒雄性不育雜交種規模化制種技術探討［J］. 辣椒雜志, 2010, 3：24-27.

［4］魏兵強, 王蘭蘭, 陳靈芝, 等. 辣椒不育系制種與可育系制種的比較研究［J］. 長江蔬菜, 2011, 24：10-11.

［5］Peterson PA. Cytoplasmically inherited male sterility in Capsicum［J］. Am Nat, 1958, 92：111-119.

［6］吳鶴鳴, 佘建明, 趙華農, 等. 羊角椒雄性不育系與保持系的細胞學觀察［J］. 江蘇農業學報, 1988, 4（2）：35-38.

［7］耿三省, 王志源, 蔣健箴, 等. 辣椒雄性不育系小孢子發生的細胞學觀察［J］. 園藝學報, 1994, 21（2）：165-169.

［8］逯紅棟, 鞏振輝, 王曉敏, 黃煒, 等. 辣椒雄性不育材料小孢子發生的細胞形態學觀察［J］. 西北植物學報, 2006, 26：1842-1845.

［9］彭婧, 鞏振輝, 黃煒, 等. 辣椒雄性不育材料 H9A 小孢子敗育機理［J］. 植物學報, 2010, 45（1）：44-51.

［10］張玲玲, 張曉芬, 陳斌, 等. 辣椒細胞質雄性不育系 FS1030A小孢子發生的細胞形態學觀察［J］. 華北農學報, 2012, 27（5）：122-126.

［11］何長征, 劉志敏, 熊興耀, 等. 辣椒細胞質雄性不育系 9704A花藥發育的細胞學觀察［J］. 園藝學報, 2008, 35：521-528.

［12］王蘭蘭, 王曉林, 魏兵強, 等. 辣椒雄性不育系及保持系小孢子發育的細胞系比較［J］. 西北農業學報, 2015, 24（1）：115-118

［13］Hirose T, Fujimc Y. A new male sterility pepper［J］. Hort Science, 1975, 10（3）：314.

［14］石太淵, 印東生, 胡迎雪. 辣椒雄性不育系小孢子發生的細胞學形態學及減數分裂研究［J］. 遼寧農業科學, 1999, （6）：7-10.

［15］王述彬, 羅向東, 戴亮芳, 等. 辣（甜）椒細胞質雄性不育系減數分裂和雄配子發生過程［J］. 園藝學報, 2004, 31：807-810.

［16］李雪峰, 梁成亮. 雜交辣椒制種技術研究及應用現狀［J］. 湖南農業科學, 2012, 22：20-22.

［17］李瑩瑩, 魏佑營, 張瑞華, 等. 辣椒雄性不育系與可育系小孢子發生的細胞學觀察［J］. 植物研究, 2006, 26（4）：411-415.

［18］王永勤, 曹家樹, 虞慧芳, 等. 白菜核雄性不育兩用系生理生化特性的分析［J］. 園藝學報, 2003, 30（2）：212-214.

［19］Villarreal F, Martín V, Colaneri A, et al. Ectopic expression of mitochondrial gamma carbonic anhydrase 2 causes male sterility by anther indehiscence［J］. Plant Mol Biol, 2009, 70（4）：471-485.

［20］鄧明華, 文錦芬, 鄒學校, 等. 辣椒核質互作雄性不育系與保持系呼吸速率研究［J］. 云南農業大學學報, 2009, 24（1）：22-25.

［21］鄧明華, 鄒學校, 周群初, 等. 辣椒細胞質雄性不育系與保持系生化特性研究［J］. 湖南農業大學學報：自然科學版, 2002, 28（6）：492-294.

［22］逯紅棟, 鞏振輝, 黃煒, 等. 9個辣椒雄性不育材料花蕾生理生化特性研究［J］. 西北植物學報, 2006, 26：832-835.

［23］Deng MH, Wen JF, Huo JL, et al. Relationship of metabolism of reactive oxygen species with cytoplasmic male sterility in pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Scientia Horticulturae, doi：10. 1016/j. scienta. 2011. 10. 027

［24］王曉林, 王蘭蘭, 陳靈芝, 等. 辣椒胞質雄性不育系與保持系生理生化特性研究［J］. 甘肅農業大學學報, 2013, 6：64-67.

［25］高夕全, 張子學, 夏凱, 等. 雄性不育辣椒中幾種內源植物激素的含量化（簡報）［J］. 植物生理學通迅, 2001, 37（1）：31-32.

［26］解海巖, 蔣培東, 王曉玲, 等. 棉花細胞質雄性不育花藥敗育過程中內源激素的變化［J］. 作物學報, 2006, 32（7）：1094-1096.

［27］沈火林, 喬志霞, 安巖. 辣椒胞質雄性不育系和保持系內源激素含量的比較［J］. 西北植物學報, 2008, 28（9）：1751-1756.

［28］Hanson MR, Bentolila S. Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development［J］. Plant Cell, 2004, 16（Suppl）：154-169.

［29］Chase CD. Cytoplasmicmal esterility：a window to the world of plant mitochondrial- nuclear interactions［J］. Trends Genet, 2006, 23：81-90.

［30］Dieterich JH, Braun HP, Schmitz UK. Alloplasmic male sterility in Brassica napus（CMS-Tournefortii-Stiewe . ）is associated with a special gene arrangement around a novel atp 9 gene［J］. Mol Genet Genomics, 2003, 269（6）：723 -731.

［31］Peng XJ, Li FH, Li SQ. Expression of a mitochondrial gene orfH 79 from the CMS-HongLian rice inhibits Saccharomyces cerevisiae growth and causes excessive ROS accumulation and decrease in ATP［J］. Biotechnol Lett, 2009, 31：409-414.

［32］Kim DH, Kang JG, Kim BD. Isolation and characterization of the cytoplasmic male sterility-associated orf456 gene of chili pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Plant Mol Biol, 2007, 63：519-532.

［33］Kim DH, Kim BD. The organization of mitochondrial atp6 gene region in male fertile and CMS lines of pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Curr Genet, 2006, 49：59-67.

［34］Gulyas G, Shin Y, Kim H, et al. Altered transcript reveals an orf507 sterility-related Gene in chili pepper（Capsicum annuum L.）［J］. Plant Mol Biol Rep, 2010, 28：605-612.

［35］Kim DH, Kim BD. Development of SCAR markers for early identification of cytoplasmic male sterility genotype in chili pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Mol Cell, 2005, 20：416-422.

［36］Jo YD, Jeong HJ, Kang BC. Development of a CMS specific marker based on chloroplast-derived mitochondual seguence in pepper［J］. Plant Biotechnol Rep, 2009, 3：309-315.

［37］魏兵強, 王蘭蘭, 陳靈芝. 辣椒胞質雄性不育基因的分子標記［J］. 西北農業學報, 2010, 19（10） ：166, 168-173.

［38］Novak F, Betlach J, Dubovsky J. Cytoplasmic male sterility in sweetpepper（Capsicum annuum L. ）. I. Phenotype and inheritance of male sterile character［J］. Z Pflanzenzucht, 1971, 65：129-140.

［39］Wang LH, Zhang BX, Daubeze AM, et al. Genetics of fertility restoration in cytoplasmic male sterile pepper［J］. Agricultural Sciences in China, 2006, 5（3）：188-195.

［40］Shifriss C. Male sterility in pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Euphytica, 1997, 93：83-88.

［41］魏兵強, 王蘭蘭, 陳靈芝, 等. 辣椒胞質雄性不育恢復性的主基因+多基因混合遺傳分析［J］. 園藝學報, 2013, 40（11）：2263-2268.

［42］Cui XQ, Wise RP, Schnable PS. The rf2 nuclear restorer gene of male-sterile T-cytoplasm maize［J］. Science, 1996, 272：1334-1336.

［43］Desloire S, Gherbi H, Laloui W, et al. Identification of the fertility restoration locus, Rfo, in radish, as a member of the pentatricopeptiderepeat protein family［J］. EMBO Rep, 2003, 4：588-594.

［44］Bentolila S, Hanson MR. Identification of a BIBAC clone that cosegregates with the petunia Restorer of fertility（Rf）gene［J］. Mol Gen Genet, 2001, 266：223-230.

［45］Brown GG, Formanova N, Jin H, et al. The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats［J］. Plant J, 2003, 35, 262-272.

［46］Komori T, Ohta S, Murai N, et al. Map-based cloning of a fertility restorer gene, Rf-1, in rice（Oryza sativa L. ）［J］. Plant J, 2004, 10：1046-1056.

［47］Small ID, Peeters N. The PPR motif—a TPR related motif prevalent in plant organellar proteins［J］. Trends Biochem Sci, 2000, 25：46-47.

［48］Hu J, Wang K, Huang WC. The rice pentatricopeptide repeat protein RF5 restores fertility in Hong-Lian cytoplasmic male-sterile lines via a complex with the glycine-rich protein GRP162［J］. The Plant Cell January, 2012, 24（1）：109-122.

［49］Zhang BX, Huang SW, Yang GM, et al. Two RAPD markers linked to a major fertility restorer gene in pepper［J］. Euphytica, 2000, 113：155-161.

［50］Min WK, Lim H, Lee YP, et al. Identification of a third haplotype of the sequence linked to the Restorer-of-fertility（Rf）gene and its implications for male-sterility phenotypes in peppers（Capsicum annuum L. ）［J］. Mol Cells, 2008, 25：20-29.

［51］Kumar S, Singh V, Singh M, et al. Genetic and distribution of fertility restoration associated RAPD markers in inbreds of pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Scientia Horticulturae, 2007, 111：197-202.

［52］Kim DS, Kim DH, Yoo JH, et al. Cleaved amplified polymorphic sequence and amplified fragment length polymorphism markers linked to the fertility restorer gene in chili pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Mol Cells, 2006, 21：135-140.

［53］Gulyas G, Pakozdi K, Lee JS, et al. Analysis of fertility restoration by using cytoplasmic male-sterile red pepper（Capsicum annuum L.）lines［J］. Breed Sci, 2006, 56：331-334.

［54］Lee J, Yoon JB, Park HG. A CAPS marker associated with the partial restoration of cytoplasmic male sterility in chili pepper（Capsicum annuum L. ）［J］. Mol Breed, 2008, 21：95-104.

［55］Lee J, Yoon JB, Park HG. Linkage analysis between the partial restoration（pr）and the rest orer-of-fertility（Rf）loci in pepper cytoplasmic male sterility［J］. Theor Appl Genet, 2008, 117：383-389.

［56］郭爽, 沈火林, 楊文才, 等. 利用抑制消減雜交技術分離辣椒細胞質雄性不育育性恢復相關EST［J］. 園藝學報, 2009, 36（10）：1443-1449.

［57］Wang LH, Zhang BX, Lefebvre V, et al. QTL analysis of fertility restoration in cytoplasmic male sterile pepper［J］. Theor Appl Genet, 2004, 109：1058-1063.

［58］Jo YD, Kim YM, Park MN, et al. Development and evaluation of broadly applicable markers for Restorer-of-fertility（Rf）in pepper［J］. Mol Breed, 2010, 25：187-201.

［59］Kim S, Park M, Yeom SI, et al. Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species［J］. Nature genetics, 2014, doi：10. 1038/ng. 2877.

［60］Qin C, Yu CS, Shen YO, et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization［J］. PNAS, 2014, 111（14）：5135-5140.

（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Cytoplasmic Male Sterility and Its Restorer of Fertility in Pepper

WEI Bing-qiang1，2WANG Lan-lan1CHEN Ling-zhi1ZHANG Ru1HOU Dong1ZHANG Jian-nong2
（1. Vegetable Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070；2. College of Horticulture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；3. Lanzhou City University, Lanzhou 730070）

It is the major way to produce hybrid seeds by cytoplasmic male sterile line because it does not need manual emasculation，thus not only the cost of breeding is reduced，but also the purity of hybrid seeds is ensured. In this paper，the developing period of male sterility，the differences of energies，substances and hormones between male sterile line and its maintaining line are reviewed. The mechanisms of male sterility and its restorer are summarized from the aspects of genetic analysis，quantitative trait loci and molecular biology.

pepper；cytoplasmic male sterility；restorer of fertility

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.001

2015-03-25

國家自然科學基金項目（31560555），農業部西北地區蔬菜科學觀測實驗站項目（2015-A2621-620321-G1203-066），甘肅省農業科學院中青年基金項目（2014GAAS27）

魏兵強，男，副研究員，博士研究生，研究方向：蔬菜種質資源利用與生物技術；E-mail：weibq1980@126.com

王蘭蘭，女，研究員，研究方向：蔬菜種質資源利用；E-mail：lanlwang@126.com