山楂提取物對急性損傷線蟲的保護作用

趙江陳純王軼菲，2王紅，2黃杰，2王浩

（1. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 天津科 技大學生物工程學院，天津 300457）

山楂提取物對急性損傷線蟲的保護作用

趙江1陳純1王軼菲1，2王紅1，2黃杰1，2王浩1

（1. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 天津科 技大學生物工程學院，天津 300457）

以秀麗隱桿線蟲（Canorhabditis elegans）為模式生物研究山楂提取物（Haworth fruit extract，HFE）對其急性氧化損傷的保護作用及其可能的作用機制。飼喂線蟲于含有不同濃度（0、25、50和100 μg/mL）HFE的NGM（Nematode growth medium）培養基中，研究HFE對線蟲急性應激耐受能力的影響。結果顯示，飼喂HFE后，秀麗線蟲表現出比正常組更高的壽命，并且在胡桃醌氧化應激、熱應激及紫外輻射應激實驗中壽命均明顯延長，熒光顯微鏡觀察發現HFE組線蟲的脂褐素自發熒光明顯減弱，并且與HFE濃度呈劑量依賴效應。 HFE能夠顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命，同時對多種氧化損傷具有較好的保護作用，改善機體的抗氧化能力，有效延緩衰老。

秀麗隱桿線蟲；山楂提取物；急性損傷；延緩衰老

在正常情況下，生物體內處于氧化與抗氧化的動態平衡狀態，保護機體免受損傷。生物體內最初的自由基是由機體正常的代謝活動產生［1］，但是當受到外界有害刺激，例如，胡桃醌在線蟲體內分解為超氧化物自由基，紫外線輻射會破壞機體內的代謝平衡，導致ROS的積累，從而機體內活性氧自由基的數量會顯著增多，造成脂質過氧化反應的發生，加速機體組織功能的損傷［2］。如果不及時清除體內過量的自由基，就會引起機體內包括蛋白、核酸及其他大分子物質的氧化損傷，對細胞活性和功能造成極大的傷害［3］。

秀麗隱桿線蟲生命周期短暫，是研究藥物藥理學和藥物影響基因表達的理想模式生物［4］。有研究表明線蟲長壽突變體能夠增強抵抗氧化應激、紫外輻射損傷、熱應激等破壞胞內動態平衡體系的刺激的能力［5］，而所有能夠提高線蟲抵抗外界刺激能力的干預措施均能夠延長線蟲的壽命［6］。

山楂作為一種藥食同源的水果，已經被衛生部認定為功能性食品的原料，并作為中草藥收錄于藥典中［7］。其富含原花青素、黃酮等多種活性成分，可以有效清除體內自由基，減少氧化損傷，具有顯著的抗氧化活性。本研究以秀麗隱桿線蟲為實驗模式生物，對山楂提取物的體內抗氧化活性進行了研究，觀察正常壽命變化，氧化應激能力的變化，以此評價HFE的抗氧化能力及調控衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲、OP50尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（E. coli）均由天津科技大學食品添加劑與營養調控研究室提供。山楂提取物購自天津尖峰有限公司。HWS-850恒溫恒濕生化培養箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；臺式冷凍離心機：美國Thermo公司；CKX41熒光顯微鏡：奧林巴斯有限責任公司；UVmini-1240紫外分光光度計：日本島津儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 壽命實驗 用M9緩沖液反復沖洗NGM培養基表面的線蟲，離心，棄上清，加入M9及線蟲裂解液，離心，20℃靜置過夜，蟲卵孵化成L1期線蟲，接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養基上，20℃培養48-54 h，即得到L4期線蟲。收集同期化線蟲，隨機分為4組，挑取線蟲 至不同濃度山楂提取物的NGM培養基（0、25、50和100 μg/mL），每組5板，每板30條。每4 d更換一次相應的新鮮培養基，每2 d定點計數1次，同時觀察線蟲的生存狀況，直至線蟲全部死亡為止，繪制線蟲壽命曲線。

1.2.2 SOD活性的測定 按照壽命實驗中的飼養方法培養5-6 d。M9緩沖液沖洗NGM表面的線蟲，離心，棄上清。加入生理鹽水冰上勻漿，離心，取上清。根據SOD測定試劑盒說明進行測定。

1.2.3 急性實驗

1.2.3.1 胡桃琨急性實驗 按照壽命實驗中的飼養方法培養5-6 d。挑取線蟲轉移到胡桃琨終濃度為500 μmol/L的NGM培養基中。每小時計數1次，挑出死亡線蟲并計數。直至線蟲全部死亡為止，繪制線蟲壽命曲線。收集存活率為20%時期的線蟲，NaN3麻醉線蟲，倒置熒光顯微鏡下，激發340-380 nm，發射430 nm，觀察線蟲體內脂褐素水平，固定曝光時間和強度，拍攝熒光圖片，檢測線蟲體內脂褐素水平。倒置熒光顯微鏡觀察線蟲體內脂褐素水平。

1.2.3.2 高溫熱急性實驗 按照壽命實驗中的飼養方法培養5-6 d。挑取線蟲轉移到NGM培養基中，30℃，預熱培養1 h，然后轉移至35℃繼續培養。每小時計數1次，挑出死亡線蟲并計數直至線蟲全部死亡為止，繪制線蟲壽命曲線。收集存活率為20%時期的線蟲，倒置熒光顯微鏡觀察線蟲體內脂褐素水平。

1.2.3.3 紫外輻射急性實驗 按照壽命實驗中的飼養方法培養5-6 d，挑取線 蟲轉移到NGM培養基中。將秀麗線蟲置于輻射強度為75 uw/cm2紫外線下，暗視野照射13 min。每30 min計數1次，挑出死亡線蟲并計數。直至線蟲全部死亡為止，繪制線蟲壽命曲線。收集存活率為20%時期的線蟲，倒置熒光顯微鏡觀察線蟲體內脂褐素水平。

1.3 數據的分析與處理

使用SPSS statistics17.0，Excel2003等軟件對實驗數據進行統計學分析處理，采用（）的方法表示結果。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異，以上結果均具有統計學意義。

2 結果

2.1 山楂提取物的活性成分

由液相譜圖結果（圖1）分析可得，山楂提取物的主要活性成分及其所占比重分別為原花青素B219.86%，表兒茶素15.27%，綠原酸3.10%，金絲桃苷2.91%，異槲皮素1.34%。

2.2 山楂提取物對線蟲壽命 的影響

HFE組線蟲的平均壽命和最高壽命均高于對照組（表1，圖1），且線蟲壽命隨著HFE濃度的升高呈明顯的劑量效應關系，其中100 μg/mL HFE的平均壽命和最高壽命分別較對照組延長了23.24%（P<0.05），25.49%（P<0.01），表明HFE能夠有效的延緩線蟲衰老，延長壽命。

圖1 高效液相色譜法測定山楂活性成分

表1 山楂提取物對線蟲壽命的影響

圖2 線蟲壽命曲線

2.3 山楂提取物對線蟲體內SOD活力的影響

SOD作為線蟲體內最主要的抗氧化酶，主要清除機體內過量的超氧化物自由基。數據（圖3）表明總SOD及Cu，Zn-SOD活力與HFE濃度呈劑量依賴效應。其中50和100 μg/mL HFE組線蟲總SOD活力分別較對照組提高了8.6%（P<0.05）、16.4%（P<0.05），100 μg/mL HFE組線蟲Cu，Zn-SOD活力提高了24.4%（P<0.05）。

圖3 線蟲體內SOD活力

2.4 急性實驗結果

2.4.1 山楂提取物對胡桃琨氧化損傷線蟲的保護作用 數據（圖4）顯示HFE能夠有效延長胡桃醌氧化損傷線蟲的平均存活時間，減少線蟲體內脂褐素堆積水平，其中50和100 μg/mL劑量組線蟲體內脂褐素熒光水平分別較對照組下降了36.73%（P<0.01）及53.65%（P<0.01）。

2.4.2 山楂提取物對熱急性損傷線蟲的保護作用

數據（圖5）顯示，0、25、50和100 μg/mL HFE組秀麗線蟲在35℃高溫環境中的平均存活時間分別為10.22、11.13、12.00和12.27 h，脂褐素相對熒光值分別為0.54、0.42、0.30和0.22單位，表明HFE延長線蟲壽命的同時也提高線蟲的熱應激耐受能力。

2.4.3 山楂提取物對紫外輻射損傷線蟲的保護作用 線蟲存活時間曲線（圖6）顯示，25、50和100 μg/mL HFE劑量組線蟲的平均存活壽命較對照組分別延長了6.20%、25.81%及35.44%，各劑量組線蟲體內脂褐素熒光含量均顯著降低（P<0.05）。

圖4 胡桃醌急性實驗結果（A：壽命曲線；B：脂褐素熒光圖）

圖5 高溫急性實驗結果（A：壽命曲線；B：脂褐素熒光圖）

圖6 紫外輻射急性實驗結果（A：壽命曲線；B：脂褐素熒光圖）

3 討論

山楂富含原花青素、黃酮等多種活性成分，可以有效清除體內自由基，減少氧化損傷［8］。Liu等［9］研究發現HFE具有明顯清除羥自由基與過氧化氫的能力，其抗氧化活性顯著高于維生素C和維生素E。本研究顯示飼喂HFE的線蟲平均壽命顯著延長，脂褐素水平顯著降低，這與汪曉燕等［10］的正丁醇可有效減少線蟲體內34.3%的ROS含量的研究結果相一致。此外，綠茶提取物兒茶素能夠影響線蟲daf-2胰島素/類胰島素信號轉導途徑，減少線蟲氧化應激損傷［11］。

秀麗隱桿線蟲是研究衰老調控機制最理想的模式生物之一。本實驗以25、50和100 μg/mL劑量HFE飼喂秀麗隱桿線蟲，研究顯示飼喂HFE的線蟲體內抗氧化酶SOD的活力顯著升高，減少脂質過氧化損傷。這與Liu等［12］的研究發現側柏中提取的500 μg/mL的正丁醇可有效減少線蟲體內34.3%的ROS含量等的研究結果相一致。有研究表明胡桃醌在線蟲體內的氧化還原反應會誘導產生細胞內的氧化應激分解產生超氧化物自由基［13，14］，本研究發現HFE能夠顯著減少氧化損傷，降低線蟲體內脂褐素水平，延長線蟲的存活時間。其中與對照組相比，100 μg/mL HFE降低了胡桃醌氧化損傷線蟲體53.6%的脂褐素水平；研究表明，線蟲壽命延長的同時其熱應激的耐受能力也會有一定程度的提升［15］，熱應激實驗中，HFE組線蟲壽命有效延長，熱應激耐受能力顯著提高；同時也有研究證明秀麗線蟲壽命的延長伴隨紫外輻射耐受能力的提高［16］，紫外輻射實驗中，HFE組線蟲壽命均高于對照組，且其效應與HFE劑量呈正相關，100 μg/mL HFE有效延長線蟲壽命34.6%，減少線蟲體內50.2%的脂褐素。這與Elena等［17］研究發現蘋果提取物能夠延長秀麗線蟲壽命，增加線蟲熱應激耐受能力，其中age-1突變體線蟲紫外輻射存活率提高74.4%，daf-16突變體線蟲紫外輻射存活率較空白對照組降低12.8%的研究結果相一致。

4 結論

一定劑量的山楂提取物可以有效降低線蟲體內脂褐素水平，在胡桃醌氧化應激、熱應激及紫外輻射氧化應激實驗中山楂提取物對秀麗隱桿線蟲有顯著的保護作用。

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（責任編輯 李楠）

The Protective Effect of Haworth Fruit Extract on Caenorhabditis elegans in Acute Damages

ZHAO Jiang1CHEN Chun1WANG Yi-fei1，2WANG Hong1，2HUANG Jie1，2WANG Hao1
（1. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

The work aims to study the protective effect of haworth fruit extract（HFE）on the acute oxidative damage and its possible protection mechanism in Caenorhabditis elegans. The C. elegans were fed with nematode growth medium（NGM）containing different dose of HFE（0，25，50 and 100 μg/mL）to study impacts of HFE on the acute stress tolerance. C. elegans with feeding in different dose of HFE had a longer lifespan than the normal group，moreover，their lifespans became significantly longer under the experiments of juglone oxidative stress，heat stress and UV radiation stress. Concurrently，the autofluorescence level of lipofuscin in HFE group of C. elegans significantly decreased and it was dose-dependent effect to the concentration of HFE. In conclusion，HFE significantly prolongs the lifespan of C. elegans and has a solid protection under a variety of oxidative stress conditions with improving the antioxidant capacity and efficient anti-aging

Caenorhabditis elegans；extract of haworth fruit；acute damage；anti-aging

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.035

2015-08-31

“十二五”國家科技計劃項目（2012BAD33B05）

趙江，男，碩士研究生，研究方向：食品營養學研究；E-mail：tozjmail@163.com

王浩，男，博士，副教授，研究方向：食品營養學研究；E-mail：wanghao@tust.edu.cn