油梨基因組DNA提取、SSR-PCR反應體系優化及引物篩選

周海蘭李紹鵬李衛亮賀軍虎包冬紅李茂富

（1. 海南大學園藝園林學院 熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室（海南大學），海口 570228；2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737）

油梨基因組DNA提取、SSR-PCR反應體系優化及引物篩選

周海蘭1李紹鵬1李衛亮1賀軍虎2包冬紅1李茂富1

（1. 海南大學園藝園林學院 熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室（海南大學），海口 570228；2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737）

旨在建立穩定可靠的油梨（Persea americana Mill）葉片DNA的提取方法和SSR-PCR反應體系及篩選出穩定的油梨SSR多態性引物，為開展油梨種質SSR分子標記提供遺傳研究的基礎。以油梨葉片為試材，比較3種油梨葉片DNA提取方法；利用L16（45）正交實驗設計對油梨SSR-PCR反應體系進行優化；利用優化的反應體系篩選引物；同時，選取5對多態性引物對45份油梨種質進行PCR擴增，進一步檢測該優化體系的穩定性。結果表明，常規2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取試劑盒法等3種DNA提取方法中，改良2×CTAB法對油梨基因組DNA的提取效果最佳；獲得最優反應體系為：20 μL總反應體系中，含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物；以此體系為基礎進行引物篩選，從73對油梨SSR引物中篩選出了30對擴增條帶清晰的多態性引物，說明該反應體系可用于油梨SSR標記的進一步研究；穩定性檢測獲得的譜帶清晰，表明該優化反應體系是穩定可靠的。由此可見，改良的2×CTAB法可用于油梨葉片DNA的大量樣本提取，優化后的SSR-PCR反應體系及篩選出的30對多態性引物可用于油梨SSR標記的進一步研究。

油梨；DNA提取；SSR標記；體系優化；引物篩選

油梨（Persea americana Mill），又名鱷梨、酪梨、牛油果等，原產于熱帶美洲，為樟科（Lauraceae）油梨屬（Persea）喬木果樹，是一種著名的熱帶水果，也是木本油料樹種之一［1］，同時，因其四季常綠、樹姿優美，還可作為一種優良的綠化樹種［2］。近年來，隨著世界油梨生產發展迅速，產量與消費量與日俱增，已成為引人矚目的熱帶亞熱帶新興水果，現已廣泛應用于食用、醫藥和化妝工業［3］，具有較高的經濟效益，經濟潛力巨大。我國于1918年就已引進油梨品種［2，4］，在廣東、廣西、云南、福建、四川、臺灣、海南等省（區）試種成功［5］，但由于我國油梨資源研究匱乏、適栽品種較少及消費市場的有限性導致油梨生產發展十分緩慢，尚未形成大規模商品性生產。故研究油梨樹種的多樣性，深入開發利用油梨資源成為目前研究的熱點［4］。

簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR），又名微衛星DNA，是以1-6個堿基為基本單元的串聯重復序列，廣泛分布于植物基因組中［6，7］。SSR標記具有通用性、高可變性、共顯性遺傳、重復性好［6-9］等優點，且數量豐富，分布廣，覆蓋整個基因組［10-14］，并能檢測出豐富多樣性。目前，該技術已廣泛用于遺傳多樣性檢測［15-19］、遺傳圖譜構建［20］、目標基因的標定［21］、指紋圖的繪制［19，22］、種質鑒定［17，23］、分子標記輔助選育［24］、品種純度鑒定［25］及雜種優勢利用［26］等研究中。在國外，分子標記已被證明在闡明油梨種質個體間的遺傳關系方面非常有用，其中小衛星技術［27-31］和微衛星技術［32-34］已經被應用于油梨品種的指紋分析、鑒定和分類；此外，種質資源鑒定、遺傳圖譜已經利用分子標記構建［35-37］，但與其他作物相比，分子標記技術在油梨方面的應用仍然不足，仍需要學者繼續利用分子標記對油梨種質進行研究。目前，在中國RAPD、SSR已分別用于油梨的品種分類及授粉研究［38，39］，但油梨的發展仍然處于不成熟階段，尤其是油梨分子標記的研究相對滯后，在一定程度上限制了油梨遺傳改良和育種工作的進行。

SSR標記雖然有許多優點，但其反應條件易受各種因素干擾，從而影響整個實驗結果。因此，建立適合的SSR檢測體系至關重要，而油梨SSR-PCR體系優化尚未見報道。本研究對油梨基因組DNA提取方法、SSR反應體系形成及引物篩選進行摸索，以期建立一套適合油梨的SSR反應體系，為油梨種質資源遺傳多樣性及親緣關系的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的油梨葉片取自于海南大學園藝園林學院油梨種質資源圃。DNA提取的實驗材料選取10個品種；引物篩選的實驗材料選取差異明顯的哈斯、大嶺7號、福爾特及巴康品種為DNA模板；體系優化選用哈斯品種。

引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，PCR所用dNTPs、Taq酶、DNA Marker和植物基因組DNA提取試劑盒均購自TaKaRa公司。PCR儀為Eppendorf Mastercycler Pro S，瓊脂糖凝膠電泳儀為Biometro Standard Power Pack P25，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳儀為北京六一儀器廠DYY-10C型。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 以油梨葉片為材料，比較2×CTAB法、改良2×CTAB法、植物DNA提取試劑盒法等3種方法的優劣；采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000 Marker為標準，在瓊脂糖凝膠電泳儀120 V恒壓下檢查DNA的完整性檢測DNA的純度和濃度；提取原液 -20℃保存。1.2.1.1 2×CTAB法 取0.1 g新鮮葉片放入研缽中，在液氮中研磨成粉末，轉入預冷的2 mL離心管，加入850 μL 65℃預熱的2×CTAB提取緩沖液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇，pH8.0），搖勻，65℃水浴1 h，期間翻動幾次；取出，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），混勻并上下顛倒數次，12 000 r/min，4℃離心10 min，將上清液轉入另一干凈的2 mL離心管中，重復此操作1或2次；再將上清液轉到另一個1.5 mL的離心管中，加入80 μL的NaAc（5 mol/L）和2/3體積的異丙醇，緩慢翻轉，混勻放置-20℃冰箱 20 min或以上；12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，用500 μL的70%乙醇洗滌沉淀兩次，放于超凈工作臺吹干，然后加100 μL的TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）充分溶解；再加RNaseA酶37℃水浴30 min，取出，-20℃保存待用。

1.2.1.2 改良2×CTAB法 取0.1 g新鮮葉片放入研缽中，加少許PVP在液氮中研磨成粉末，轉入預冷的2 mL離心管，加入850 μL STE緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2% PVP，1% β-巰基乙醇，pH8.0），搖勻，置于冰上5 min；4℃條件下5 000 r/min離心8 min，棄上清后繼續加入850 μL STE緩沖液清洗，再次4℃條件下5 000 r/min離心8 min，棄上清；加入850 μL 65℃預熱的2×CTAB提取緩沖液，用振蕩器振蕩1 min，充分混勻，放入水浴鍋中水浴約1 h，期間來回輕緩顛倒幾次；取出至于冰上，加入150 μL NH4AC混勻，靜置5 min，4℃下12 000 r/min離心10 min；取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），放入脫色搖床上來回搖蕩10 min，放入離心機，4℃條件下12 000 r/min離心10 min；將上清液轉入另一干凈的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），放入脫色搖床上來回搖蕩5 min，放入離心機，4℃下12 000 r/min離心10 min，根據上清液情況，選擇是否繼續重復抽提一次；將上清液轉到另一個1.5 mL的離心管中，加入80 μL的NaAc（5 mol/L）和2/3體積的異丙醇沉淀，緩慢翻轉，混勻放置-20℃冰箱 20 min或以上；12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，用500 μL的70%乙醇洗滌沉淀兩次，放于超凈工作臺吹干，然后加100 μL的TE緩沖液充分溶解；再加1 μL RNaseA酶37℃水浴30 min，取出，-20℃保存待用。

1.2.1.3 植物基因組DNA提取試劑盒法 TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit步驟參照說明書去多糖多酚的Protocol-Ⅱ步驟進行。

1.2.2PCR擴增及體系優化 PCR擴增結果會因Mg2+、dNTP、Taq酶、引物濃度及模板DNA量等因素而受到影響，為了得到清晰、客觀、準確的結果，需對反應條件進行優化后再進行大量樣本擴增。針對影響PCR擴增反應體系的5個因素（Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物及模板DNA量），結合相關文獻報道，選用L16（45）正交實驗設計，共16個處理組合，每個組合3次重復，探討正交實驗因素水平和正交設計見表1和表2。

體系優化所用引物AVAG21，反應體積為20 μL。PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。檢測用2% 瓊脂糖凝膠，120 V恒電壓，電泳約40 min，凝膠成像系統觀察并拍照。

1.2.3 引物篩選 實驗選用的SSR引物共73對，其中48對參考Sharon等［35］的油梨SSR引物序列，25對參考Ashworth等［40］的油梨SSR引物序列。根據公式 =1-（1-1/2）n（n為樣品數， 為有多態性引物的選中概率）計算選中的有多態性引物的概率，本研究利用4個DNA樣品進行測試，則有多態性引物的選中概率為93.75%。選取穩定性高、重復性好、有多態性產物的引物對模板DNA進行PCR擴增。

由于引物的最佳退火溫度不同，利用TD-PCR進行大量引物多態性篩選，反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，其后每個循環退火溫度下降1℃，13個循環；94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，27個循環；72℃延伸10 min。PCR產物檢測用2% 瓊脂糖凝膠，120 V恒電壓電泳約40 min；PCR產物分離利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠，60 W恒定功率電泳1.5-2 h，參考楊珺的銀染法［41］進行銀染檢測。1.2.4 油梨SSR-PCR的多態性驗證 選取較好的方法大量提取的油梨基因組DNA，選用篩選出的5對多態性引物、優化的20 μL SSR-PCR反應體系及TD-PCR程序對提取的DNA進行PCR擴增驗證，檢測DNA、優化體系及程序是否滿足分子研究要求。

2 結果

2.1 基因組DNA的提取與檢測

3種方法提取的DNA比較：A260/A280的比值常用來表示DNA的純度，核酸蛋白檢測儀結果顯示，改良2×CTAB法產率最高；常規的2×CTAB法次之，試劑盒法最低；常規的2×CTAB法A260/A280值在1.5-1.7之間，部分DNA純度符合SSR的要求，改良2×CTAB法和DNA試劑盒法的該值在1.7-2.0之間，說明DNA的純度都符合SSR的要求。DNA電泳檢測結果顯示，常規2×CTAB法大部分泳道點樣孔有雜質，DNA條帶較暗，部分拖尾，有蛋白質或者糖類雜質以及RNA污染（圖1-A）；改良2× CTAB法提取的油梨葉片DNA條帶亮度最大且各條帶較均勻清晰，穩定性高，雜質較少（圖1-B）；DNA試劑盒法提取的DNA條帶最暗，亮度均勻幾乎無雜質，DNA較純，但成本高，不利于大批量樣品DNA的提取（圖1-C）。由此選用改良2×CTAB法提取大批量油梨植物基因組DNA。

表1 油梨SSR反應體系正交設計因素水平表

表2 SSR-PCR正交設計表L16（45）

2.2 SSR-PCR體系優化

由圖2可見，正交設計SSR-PCR反應體系的擴增結果存在明顯差異。在實驗設計的16個組合、3次重復中：組合1、2、3、4、7、12、14擴增條帶較弱或未擴增出條帶，穩定性和重復性低；組合5、9、10、11、13、15、16主帶明顯，但存在非特異性帶；組合6、8主帶明顯，無非特異性帶，但兩者相對而言第6組合擴增條帶亮度大、清晰，且穩定性好、重復性高。綜合比較分析，第6組合為油梨的最優SSR-PCR反應體系，即20 μL 總反應體系中，含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTP、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物。

2.3 引物篩選結果

采用優化的SSR-PCR反應體系和TD-PCR程序進行引物多態性篩選，擴增得到清晰且特異性強的譜帶（圖3）；結果表明該體系擴增不同引物時，條帶依然清晰穩定，重復性好，因此該體系適用于油梨品種進行SSR-PCR擴增；對于大量引物的多態性篩選，TD-PCR省去了眾多引物退火溫度的摸索，可以減少非特異性帶的產生，有效提高篩選的特異性和效率。73對引物中，初步篩選出30條擴增較好的多態性引物，多態性的引物達到41%。

圖1 三種方法提取的DNA凝膠電泳圖

圖2 SSR-PCR正交實驗結果

圖3 油梨多態性引物篩選

2.4 油梨的SSR多態性檢測

選用已篩選出的5對多態性引物，利用優化的SSR-PCR反應體系和TD-PCR程序對45份油梨種質的DNA進行擴增，所選用的5對多態性引物均得到很好的擴增效果，獲得了清晰穩定的譜帶（圖4）。電泳結果顯示該反應體系進行大量PCR擴增時，條帶依然清晰穩定，重復性好，表明建立的SSR反應體系穩定可靠，且篩選的引物多態性明顯，適用于油梨種質進行SSR-PCR擴增。

3 討論

20世紀80年代，CTAB法開始在國內外廣泛應用，CTAB是一種去污劑，既能裂解細胞又能有效沉淀多糖，因此有其獨到優點［42］。在30多年的發展中，許多學者對CTAB法不斷改進，除在技術上的改進，大多是在DNA提取液成分配比上發生變化，并針對不同物種形成獨特的優化提取方法。許多報道利用高鹽緩沖條件下去除植物DNA中多糖［43-46］，廣泛采取β-巰基乙醇、抗壞血酸或PVP（聚乙烯毗咯烷酮）等抗氧化劑來去除植物組織中的 多酚類物質［47，48］。樟科植物含有大量的多糖、鞣質、多酚、單寧等次生代謝物，在DNA提取過程中經裂解液處理后，細胞破碎，釋放出次生代謝物，使提取液變得異常黏稠，操作困難，導致提取的DNA質量差，溶解困難［49］，對PCR產生影響，導致實驗結果不穩定和不可靠。本研究改良2×CTAB法所提DNA濃度及純度均符合SSR-PCR擴增的要求，且該法在DNA獲得量上優于常規2×CTAB法和DNA試劑盒法，原因主要在于其解決了黏稠、易氧化褐變及DNA純度低等問題。常規方法提取會使這些物質與DNA 發生不可逆的結合使 DNA 呈褐色、黏稠，影響DNA質量，不能用于PCR擴增和酶切等分子生物學研究；經多次實驗發現與常規2×CTAB法相比，改良2×CTAB法中樣品中加入少許PVP研磨，反復用STE緩沖液進行洗脫，同時在65℃水浴核裂解后加入150 μL 7.5 mol/L醋酸銨溶液可在很大程度上解決黏稠問題，同時發現裂解后加入醋酸銨溶液冰上靜置10 min可以大量去除蛋白質雜質。抽提時，與上下顛倒數次相比，放入脫色搖床上反復搖蕩幾分鐘，可獲得較透明的上清液。在木本植物DNA提取中，提取液加入β-琉基乙醇、PVP（聚乙烯毗咯烷酮）等這幾種抗氧化劑去除酚類物質是必須的，這與閆桂琴等［50］的研究結果一致。故選用改良2×CTAB法作為后期分子研究實驗的油梨基因組DNA提取方法對油梨大量樣本進行提取。

SSR-PCR反應涉及諸多因素，每個因素的反應參數對反應體系有很大影響，確定合適的反應參數是SSR分析的前提。SSR-PCR反應體系中各組分均可能影響擴增的特異性、敏感性和產量，采用多因素聯合優化的正交實驗設計，借助合適的正交表，利用正交表的均衡分散性和整齊可比性，可有效解決理論與實際可行的實驗次數的矛盾，以及實際所做的有限量實驗與要求全面掌握事物內在規律之間的矛盾［51］。影響PCR擴增效率的因子主要有5個，Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA和引物的濃度對PCR擴增效率都起著抑制或促進的作用。利用正交設計優化油梨SSR反應體系是一種有效、適用而且簡便的方法，能較好地識別SSR-PCR反應體系中的關鍵影響因素，并優化反應條件。本研究利用正交實驗設計方法建立了適合油梨SSR-PCR反應體系的優化組合，即20 μL總反應體系中，含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq酶、0.5 μmol/L引物，這與油松［52］、鴨茅［53］、大豆［54］、東興金花茶［55］、油葵［56］、冬瓜［57］、菊花［58］等植物已報道的SSR-PCR優化體系都有所不同，說明不同物種的SSR-PCR優化反應體系存在一定差異。

SSR-PCR反應體系的優化、建立及引物的篩選是SSR多態性標記應用的基礎。影響SSR反應的主要因子除了Mg2+、dNTPs、Taq酶、模板等外，SSRPCR擴增時的退火溫度也是一個關鍵要素，對擴增條帶有明顯影響。本研究選用TD-PCR擴增程序進行大量SSR引物多態性篩選，發現TD-PCR可以有效避免退火溫度過高或過低對SSR-PCR擴增反應造成的影響，省去了眾多引物退火溫度的摸索，加快了實驗進程；可以減少非特異性帶的產生，有效提高篩選的特異性和效率；選用的TD-PCR引物篩選程序為今后油梨SSR引物篩選提供一定的參考。

圖4 引物AUCR418（A）和AVD017（B）對45份油梨種質的擴增驗證結果

4 結論

本研究結果表明改良2×CTAB法對油梨基因組DNA的提取效果最佳；20 μL SSR-PCR最優反應體系含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物；以此體系為基礎進行引物篩選，從73對油梨SSR引物中篩選出了30對擴增條帶清晰的多態性引物。

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（責任編輯 李楠）

DNA Extraction，Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Persea americana

ZHOU Hai-lan1LI Shao-peng1LI Wei-liang1HE Jun-hu2BAO Dong-hong1LI Mao-fu1
（1. Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of Education / College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228；2. Tropic Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropic Agricultural Sciences，Danzhou 571737）

This study is to establish a stable and reliable DNA extraction method，optimize the SSR-PCR reaction system，and screen the stable polymorphism primers for avocado（Persea americana Mill）SSR for providing the genetic foundation to conduct the SSR molecular marker of germplasm in avocados. Taking avocado’ leaves as the study material，3 avocado DNA extraction methods were compared，based on the L16（45）orthogonal experiment design，the SSR-PCR reaction system in avocados was optimized，and then by optimized reaction system the SSR primers were screened. To further test the stability of the optimized SSR-PCR system，the germplasms in 45 pieces of avocados were amplified by PCR using 5 pairs of polymorphism primers. The results showed that：among 3 DNA extraction methods of conventional 2×CTAB method，improved 2×CTAB method，and plant DNA kit method，the improved 2×CTAB method was the best regarding the extraction effect of avocado genomic DNA. The optimal SSR-PCR reaction system in avocados was：a total volume of 20 μL containing 40 ng of genomic DNA，1.5 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTPs，0.5 U Taq DNA polymerase，0.5 μmol/L primer. Based on the above optimized reaction system，30 pairs of polymorphism primers with clear bands were screened from 73 SSR primers of avocados，indicating that the reaction system can be used forthe further study of SSR markers in avocados. The bands of stability test were clear，showing that the optimized system was stable and reliable. Thus，improved 2×CTAB method can be used in DNA extraction of plentiful samples，and the optimized SSR-PCR reaction system and the 30 polymorphism primers can be utilized for the further study of SSR markers in avocados.

Persea americana Mill；DNA extraction；SSR marker；system optimization；primer screening

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.019

2015-09-16

海南省星火產業帶專項資金項目（HNXH201532），農業部熱帶作物種質資源保護項目（15RZZY-23）

周海蘭，女，碩士研究生，研究方向：種質資源，E-mail：398803451@qq.com；李紹鵬為本文并列第一作者

李茂富，男，碩士，副教授，研究方向：果樹栽培生理；E-mail：hafu98022@126.com