豬體細(xì)胞核移植技術(shù)研究進(jìn)展

張宏燕信吉閣，2

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201）

豬體細(xì)胞核移植技術(shù)研究進(jìn)展

張宏燕1信吉閣1，2

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201）

豬體細(xì)胞核移植技術(shù)已發(fā)展十年多，技術(shù)日趨完善，許多實驗室已可獲得克隆豬和基因修飾豬。近年來新興了多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)，為基因修飾豬研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，推進(jìn)了基因修飾豬的研究從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向應(yīng)用研究。介紹了豬體細(xì)胞核移植技術(shù)的發(fā)展歷程，主要技術(shù)環(huán)節(jié)的優(yōu)化，并對豬體細(xì)胞核移植的技術(shù)優(yōu)勢，在農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥上的應(yīng)用及意義，存在問題與前景等進(jìn)行了概述。

體細(xì)胞核移植技術(shù)；豬；基因修飾；轉(zhuǎn)基因

核移植技術(shù)是創(chuàng)建基因完全相同的個體的過程（即為克?。涯讣?xì)胞的成熟，供體細(xì)胞的分離和處理，重構(gòu)胚的人工激活，胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等過程。自從2000年獲得首例體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）克隆豬［1］，這項技術(shù)發(fā)展迅速，在許多實驗室里都成功獲得了不同供體細(xì)胞來源的克隆豬。但是由于在豬物種上還沒有建立起嚴(yán)格意義上胚胎干細(xì)胞（embryonic stem， ES），豬的基因修飾研究途徑有限。獲得基因修飾豬的主要方法是在體細(xì)胞上進(jìn)行基因修飾，再進(jìn)行SCNT［2-4］。該技術(shù)路線先對體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，然后把其作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植，這樣可以保證獲得基因修飾動物，且不存在嵌合體問題。目前大動物獲得基因修飾大動物主要途徑是SCNT。

1　豬的SCNT發(fā)展歷程

克隆豬的研究發(fā)展開始于1989年，Prather等［5］報道了第一例成功的克隆豬實驗，研究者利用4-細(xì)胞期卵裂球作為核供體，MⅡ期卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞，共移植88個胚胎到受體母豬體內(nèi)并進(jìn)一步生長發(fā)育，但只誕生了一頭克隆豬。直到十年后才有類似的胚胎核移植的成功報道［6］。首例SCNT克隆動物“多莉”綿羊建立后，豬的SCNT研究進(jìn)展卻相對緩慢。由于豬初期胚胎培養(yǎng)技術(shù)相對落后，豬卵母細(xì)胞對外界應(yīng)激敏感，人工激活效率低，移植胚胎囊胚發(fā)育率低等原因，直至2000年，才有3個研究機(jī)構(gòu)獲得了體細(xì)胞克隆豬。Polejaeva等［1］獲得了5頭健康的體細(xì)胞克隆豬。該實驗采用了與以往核移植技術(shù)不同的新方法，研究者第一次將豬的顆粒層細(xì)胞作為供體細(xì)胞與無核的卵母細(xì)胞融合，18 h后將供體細(xì)胞核從第一個卵母細(xì)胞中取出，移植到去核的受精卵細(xì)胞中。研究人員采用這種雙核移植的方法是因為他們猜測在最初的“一步法”中，核移植后的激活過程產(chǎn)生的刺激物不能提供胚胎發(fā)育的全部條件。該報道使研究者認(rèn)識到豬克隆的過程比其他動物復(fù)雜和困難得多。但Onishi等［7］使用顯微注射直接將豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs）的細(xì)胞核注入到無核的卵母細(xì)胞中，成功地克隆了一頭活的小豬。Onishi的研究證實了二步法的核移植對獲得SCNT豬不是必須的。以上兩項研究都是采用豬的體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞而非體外人工培養(yǎng)的未成熟卵母細(xì)胞。因體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞是非常昂貴的，Betthauser等［8］選擇用體外培養(yǎng)的成熟卵母細(xì)胞，并系統(tǒng)地優(yōu)化SCNT的各個步驟，建立了一種重復(fù)性很高的方法，通過該實驗方案能順利獲得轉(zhuǎn)基因豬。Bondioli等［9］研究者以體內(nèi)成熟的卵子為胞質(zhì)受體，以轉(zhuǎn)基因公豬皮膚成纖維細(xì)胞為核供體細(xì)胞，構(gòu)建了299枚的核移植胚胎，獲得2頭仔豬。Park等［4］獲得了首例通過成纖維細(xì)胞基因修飾，再進(jìn)行核移植的轉(zhuǎn)基因豬。隨后Lai等［10］利用同源重組（homologous recombination，HR）方法在微型豬成纖維細(xì)胞中進(jìn)行GGTA1基因敲除，然后核移植到體外無核成熟卵母細(xì)胞中，獲得了4頭存活的GGTA1基因敲除豬。Walker等［11］研究用體外成熟的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體，選擇PFFs為核供體，移植重構(gòu)胚到5頭自然發(fā)情的受體母豬，其中4頭懷孕產(chǎn)仔28頭，效率分別為7％、5％、

12％和6.6％，總效率為5.5％，優(yōu)化了實驗細(xì)節(jié)，包括降低了融合液中的鈣離子濃度、選用體外成熟時間較短的卵母細(xì)胞、調(diào)節(jié)溶液的滲透壓等，但研究沒能確定提高了克隆效率的因素［11］。豬的SCNT技術(shù)逐步完善發(fā)展。近年來國內(nèi)多家研究機(jī)構(gòu)也已獲得了克隆豬和基因修飾豬。同時多種特有的地方豬品種克隆成功，如版納微型豬［12，13］、中國實驗用小型豬［14］、巴馬豬［15］、東北民豬［16，17］和五指山豬［18］等。

2　豬的SCNT主要技術(shù)環(huán)節(jié)

SCNT是一項非常復(fù)雜的實驗操作，其成功與否受到多種因素的影響，包括物種、受體卵子的來源、細(xì)胞核供體的細(xì)胞類型、核移植前供體細(xì)胞的處理、卵母細(xì)胞人工激活的方法、胚胎培養(yǎng)、重構(gòu)胚胎細(xì)胞核中體細(xì)胞印記的損失和核移植技術(shù)的正確操作等。此外，豬的SCNT具有一些獨特特征，是至少要有個好的胚胎來誘導(dǎo)和維持妊娠。因此要提高核移植成功的幾率，就要在每一步中摸索最適宜的條件。SCNT的主要影響因素包括以下幾方面：

2.1供體細(xì)胞

在小鼠的核移植中，有研究測試了8種不同起源、不同的基因背景的雌雄胎兒和成年鼠的細(xì)胞類型發(fā)現(xiàn)，只有纖維細(xì)胞、胚胎性腺和卵丘細(xì)胞能成功獲得轉(zhuǎn)移基因動物［19］。許多細(xì)胞型在植入宮壁后反復(fù)不能發(fā)育。在克隆牛方面，有研究測試15種來自不同的基因背景雌雄個體胎兒、新生和成年牛的體細(xì)胞供體發(fā)現(xiàn)，只能利用卵丘細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和肝細(xì)胞，才能獲得轉(zhuǎn)基因動物［20］。在克隆豬方面，至少有10種細(xì)胞型已經(jīng)證實了具有完全的克隆能力，如PFFs、卵丘細(xì)胞和脂肪原細(xì)胞等［21］。Wei等［13］比較了PFFs、新生豬成纖維細(xì)胞，成年豬成纖維細(xì)胞的克隆能力，PFFs和新生豬成纖維細(xì)胞卵裂率、囊胚率、懷孕率等均高于成年豬成纖維細(xì)胞。現(xiàn)已經(jīng)證明了很多物種中可用于核移植的供體細(xì)胞群體。另一影響因素是供體細(xì)胞所處的細(xì)胞周期，但在核移植領(lǐng)域?qū)@一問題的看法目前頗有爭議。而用于轉(zhuǎn)基因豬的核供體細(xì)胞必須具備兩個特征，即能夠直接發(fā)育和具有增殖能力，這樣可有選擇進(jìn)行基因修飾。PFFs因具有很強(qiáng)的增生能力，成為早期研究首選的核供體細(xì)胞。SCNT面臨的問題是供體細(xì)胞衰老問題，無足夠的生長周期完成基因修飾等操作。近年來發(fā)展起來的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）技術(shù)，為沒有獲得真正ES系的物種提供一種新型的核移植供體細(xì)胞。2010年有研究利用小鼠iPSCs通過核移植途徑得到克隆小鼠［22，23］，表明了iPSCs與ES一樣具有全能性，可以代替ES來實現(xiàn)對動物基因組的修飾。但是之后一直未能成功誘導(dǎo)并培育出iPS克隆豬。直至2013年中國研究者首次在世界上獲得成活的iPS克隆豬［24］。iPS的出現(xiàn)為大動物基因打靶奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，可以通過嵌合體技術(shù)，獲得生殖系嵌合的動物，經(jīng)過交配獲得基因修飾動物，同時可將這些基因打靶iPSCs為核供體，通過核移植技術(shù)獲得基因修飾克隆動物。這項技術(shù)將能用于轉(zhuǎn)基因豬的培育，在豬種工程培育，以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

2.2卵母細(xì)胞

一般認(rèn)為，體外成熟培養(yǎng)而獲得的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力不如體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞。最初兩項豬的SCNT研究是選擇以體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞作為核移植胞質(zhì)受體［1，7］，但很快以體外成熟卵母細(xì)胞作為受體也獲得了體細(xì)胞克隆豬［8］。有研究比較了兩種來源卵母細(xì)胞的差異發(fā)現(xiàn)，兩者的囊胚率并無顯著差異［25］。在卵母細(xì)胞成熟復(fù)雜變化過程中，核成熟進(jìn)程與細(xì)胞質(zhì)成熟相互影響，相互促進(jìn)［26］。影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素包括卵母細(xì)胞成熟抑制因子、促成熟因子，激素影響、卵泡大小、卵丘細(xì)胞形態(tài)、卵泡液、體外成熟時間、培養(yǎng)溫度及細(xì)胞生長因子等。有研究證實豬體外培養(yǎng)胚胎囊胚率比其他畜牧品種低［27］。通過體內(nèi)沖卵胚、體外受精、核移植獲得的胚胎，經(jīng)體外培養(yǎng)后檢測囊胚細(xì)胞數(shù)少于體內(nèi)發(fā)育胚胎的囊胚細(xì)胞數(shù)［28］。導(dǎo)致出現(xiàn)這些問題的原因可能是由豬體外培養(yǎng)系統(tǒng)仍不完善而引起。有研究顯示低氧分壓（7％ O2）培養(yǎng)條件下能提高豬孤雌胚胎的囊胚率和囊胚的細(xì)胞數(shù)，PZM3胚胎培養(yǎng)液與NCSU23相比，能顯著提高囊胚細(xì)胞數(shù)［14］。用瘦素（Leptin）處理豬卵母細(xì)胞及體外受精胚胎發(fā)現(xiàn)Leptin能提高卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育［29］。

2.3核移植胚胎的構(gòu)建

在SCNT中需要對卵母細(xì)胞去核。常用去核的化學(xué)方法是利用雙苯酰亞胺使染色體顯影，但這種化合物影響豬卵母細(xì)胞發(fā)育。因為體外成熟后處于第2次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞核通常位于第一極體附件的胞質(zhì)中，可通過吸走第一極體及附近胞質(zhì)的方法去核，這種方法稱為盲吸去核法，其成功率在85％-90％之間［30］。近年來研發(fā)出了紡錘體觀測儀，能利用偏振光的原理，不需染色即可直接觀察到減數(shù)分裂中期的染色體，從而達(dá)到100％去核效率，目前這種去核方法被認(rèn)為是對卵母細(xì)胞損傷最小、效率最高的方法。供體細(xì)胞核導(dǎo)入胚胎的方法主要有兩種，直接注供體細(xì)胞核或是注入完整的供體細(xì)胞到卵黃周隙。供體細(xì)胞核植入無核卵母細(xì)胞中后，重建的胚胎須激活才能繼續(xù)生長，一般由多種物理的和化學(xué)的因素來人工誘導(dǎo)完成。有研究發(fā)現(xiàn)在融合后延遲3 h，再進(jìn)行激活可以提高效率［31］。Kuhholzer等［32］報道電刺激的卵母細(xì)胞能獲得接近20％的囊胚率。潘偉榮等［33］研究電激活參數(shù)對豬卵母細(xì)胞孤雌胚胎發(fā)育的影響，并優(yōu)化電激活技術(shù)體系。Zhang等［34］研究表明用血清饑餓法和阿菲迪霉素處理供體細(xì)胞能提高重構(gòu)胚的發(fā)育能力。

2.4胚胎移植

考慮到體外培養(yǎng)可能對核移植胚胎的不利影響，胚胎移植一般選擇發(fā)育早期階段的胚胎，在顯微操作第2天進(jìn)行胚胎移植。在懷孕期第12天左右，在豬妊娠期間代孕豬對胚胎的識別需要來自4個或者更多胚胎的信號。核移植胚胎著床效率低，需要移植大量的胚胎。若無足夠的胚胎用來移植則可采用以下兩種方法，一種方法是植入“輔助胚胎”來幫助誘導(dǎo)和維持懷孕，可以選擇能夠懷孕但在懷孕的第30天因染色體印記而退化的孤雌生殖的胚胎，也可以選自正常的交配得到的受精胚胎；另一種方法是在移植第12天時使用藥物處理，以維持妊娠［2］。

當(dāng)前的克隆豬生產(chǎn)效率仍然較低（1％-2％）［35］。SCNT的過程是一個表觀遺傳學(xué)重編程的過程，目前普遍認(rèn)為克隆動物技術(shù)效率低的主要原因是由于表觀遺傳學(xué)重編程不完全或發(fā)生異常。核移植研究中發(fā)現(xiàn)，用一些影響細(xì)胞核重編程過程中DNA和組蛋白甲基化或乙?；乃幬锾幚砗艘浦仓貥?gòu)胚胎可以提高克隆胚胎的發(fā)育率，如使用去乙酰化酶抑制劑TSA、Scriptaid等來處理克隆胚胎，可顯著提高豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育囊胚率［36，37］。

3　豬的SCNT的意義及應(yīng)用

豬被認(rèn)為是重要的哺乳動物模型，其在解剖、生理、器官大小、器官發(fā)育、營養(yǎng)代謝、基因表達(dá)、疾病發(fā)展過程等多方面與人類十分相似；同時其具有基因多樣性，繁殖周期短，一窩產(chǎn)子多，5個月就能達(dá)到性成熟，壽命較長等優(yōu)勢特征，便于根據(jù)特殊需要進(jìn)行選育。與經(jīng)典的模式動物小鼠相比，由于嚙齒類發(fā)育過程、解剖生理指標(biāo)與人類區(qū)別較大，對于人類疾病的參考價值較小，此外在生物反應(yīng)器的制備要求以及異種器官移植等方面小鼠也不能達(dá)到要求。而以猴子為代表的非人類靈長類動物存在資源和倫理上的限制及技術(shù)上的不成熟。因此對豬的基因組實現(xiàn)定點修飾在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域有重要的意義。除了SCNT方法外，成功獲得轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)還有原核顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。1985年，由Hammer等［38］利用原核顯微注射法獲得基因修飾豬。但該技術(shù)存在目的基因整合位點隨機(jī)性，且易產(chǎn)生嵌合體，同時若沒有發(fā)生生殖系嵌合則不能獲得基因修飾動物的后代。因此該方法并不是適用于大型動物。此外，病毒載體法和精子載體法在轉(zhuǎn)基因豬制作上的效果都不理想，如病毒載體法目的基因大小受到限制、易產(chǎn)生嵌合體且存在安全上隱患，精子載體法存在隨機(jī)整合、實驗重復(fù)性差等問題。目前SCNT方法是構(gòu)建基因修飾豬的主流方法。

從2002年首例基因敲除豬報道以來，利用傳統(tǒng)同源重組和SCNT方法僅獲得了幾種基因打靶豬［10，39，40］。傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)利用的是細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的HR，其本身效率就很低，通常只有10-6［41］，因而體外基因定點整合的效率是極低的，并且基因打靶通常需要加入正負(fù)篩選標(biāo)記，經(jīng)過長時間的體外培養(yǎng)和大量藥物篩選，細(xì)胞易衰老，染色體易損傷，實際操作的工作量增加，這些因素限制了獲得基因修飾豬的效率。所以大動物基因敲除模型獲得成功的報道并不多，低效率因素嚴(yán)重制約了大動物基因修飾模型研究的發(fā)展。近年來新興了多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)，包括鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nuclease，TALENs）及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9 （CRISPR-associated 9）技術(shù)等。這些新興技術(shù)極大地提高了基因敲除的效率和特異性，為豬的高效基因打靶研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。目前ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9在豬物種上均實現(xiàn)基因定點修飾，已獲得了多種修飾豬［41-43］。這些新技術(shù)為基因修飾豬構(gòu)建研究開辟了新的途徑，基因修飾豬將在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中展開更多深入的研究。

豬的SCNT技術(shù)的建立在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)有廣泛的應(yīng)用。一方面利用SCNT可以加速豬種遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良品種傳播；同時利用SCNT可以保存優(yōu)良豬種資源，冷凍體細(xì)胞實驗操作上比冷凍精液或胚胎更為容易。另一方面豬的SCNT與基因修飾技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)基因修飾豬，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可提高豬肉生產(chǎn)效率，生產(chǎn)更為健康的產(chǎn)品，提高豬抗疾病能力［44］等；在醫(yī)藥領(lǐng)域制作轉(zhuǎn)基因豬生物反應(yīng)器，通過乳腺、血液等生產(chǎn)醫(yī)用蛋白、藥物、重組抗體等［45］；同時在豬上進(jìn)行人類相關(guān)疾病致病基因的修飾，能高保真地復(fù)制一些人類疾病，用于研究疾病機(jī)理、藥物研發(fā)治療方法等；豬也被認(rèn)為是一種比較理想的異種器官移植供體來源動物［46-48］，尤其是小型豬在器官大小和外科手術(shù)操作上的優(yōu)勢使之更適合于異種器官移植研究。用經(jīng)過一定遺傳修飾而得到的克隆動物提供心臟、肝、腎等器官，可大大降低異種器官移植時存在的超急性排斥反應(yīng)。這也是豬核移植技術(shù)的重要意義之一。

盡管利用SCNT已成功獲得了許多種克隆動物，但是對于這一技術(shù)本身的基礎(chǔ)研究還不夠完善，對其機(jī)理研究還不是很深入，克隆過程中還存在亟待解決的問題，如豬的SCNT效率還很低，克隆動物易出現(xiàn)出生體重異常，器官缺陷，先天疾病等問題。SCNT的過程是一個表觀遺傳學(xué)重編的過程，目前普遍認(rèn)為克隆動物技術(shù)效率低的主要原因是由于表觀遺傳學(xué)重編程不完全或發(fā)生異常。隨著基礎(chǔ)研究的深入及相關(guān)技術(shù)完善，能進(jìn)一步提高豬SCNT的效率，促進(jìn)基因修飾豬研究的發(fā)展。

［1］ Polejaeva IA， Chen SH， Vaught TD， et al. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells［J］. Nature， 2000， 407 （6800）：86-90.

［2］ Lai L， Park KW， Cheong HT， et al. Transgenic pig expressing the enhanced green fluorescent protein produced by nuclear transfer using colchicine-treated fibroblasts as donor cells［J］. Mol Reprod Dev， 2002， 62（3）：300-306.

［3］ Lai L， Tao T， Machaty Z， et al. Feasibility of producing porcine nuclear transfer embryos by using G2/M-stage fetal fibroblasts as donors［J］. Biol Reprod， 2001， 65（5）：1558-1564.

［4］ Park KW， Cheong HT， Lai L， et al. Production of nuclear transferderived swine that express the enhanced green fluorescent protein［J］. Anim Biotechnol， 2001， 12（2）：173-181.

［5］ Prather RS， Sims MM， First NL. Nuclear transplantation in early pig embryos［J］. Biol Reprod， 1989， 41（3）：414-418.

［6］ Li GP， Tan JH， Sun QY， et al. Cloned piglets born after nuclear transplantation of embryonic blastomeres into porcine oocytes matured in vivo［J］. Cloning， 2000， 2（1）：45-52.

［7］ Onishi A， Iwamoto M， Akita T， et al. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei［J］. Science， 2000， 289（5482）：1188-1190.

［8］ Betthauser J， Forsberg E， Augenstein M， et al. Production of cloned pigs from in vitro systems［J］. Nat Biotechnol， 2000， 18（10）：1055-1059.

［9］ Bondioli K， Ramsoondar J， Williams B， et al. Cloned pigs generated from cultured skin fibroblasts derived from a H-transferase transgenic boar［J］. Mol Reprod Dev， 2001， 60（2）：189-195.

［10］ Lai L， Kolber-Simonds D， Park KW， et al. Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning［J］. Science， 2002， 295（5557）：1089-1092.

［11］ Walker SC， Shin T， Zaunbrecher GM， et al. A highly efficient method for porcine cloning by nuclear transfer using in vitromatured oocytes［J］. Cloning Stem Cells， 2002， 4（2）：105-112.

［12］ 葉雷， 李紅， 魏紅江， 等. 成年版納微型豬近交系克隆豬的制備［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2012， 43（9）：1491-1498.

［13］ Wei H， Qing Y， Pan W， et al. Comparison of the efficiency of Banna miniature inbred pig somatic cell nuclear transfer among different donor cells［J］. PLoS One， 2013， 8（2）：e57728.

［14］ 潘登科， 張運海， 孫秀柱， 等. 低氧培養(yǎng)早期胚胎克隆小型豬（Sus scrofa）［J］. 科學(xué)通報， 2006（4）：415-419.

［15］ 盧晟盛， 呂培茹， 劉紅波， 等. 廣西巴馬小型豬克隆胚的構(gòu)建及胚胎移植［J］. 動物學(xué)雜志， 2008（6）：147-153.

［16］ 劉忠華， 田江天， 重鄭， 等. 體細(xì)胞核移植克隆民豬：培養(yǎng)液對卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響［J］. 中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)， 2007， 37（6）：634-640.

［17］ 劉忠華， 宋軍， 王振坤， 等. 體細(xì)胞核移植生產(chǎn)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬［J］. 科學(xué)通報， 2008， 53（5）：556-560.

［18］ 王飛， 馮沖， 龍川， 等. 利用體細(xì)胞LOH突變制備α 1， 3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GGTA 1）缺失的五指山小型豬［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2013， 44（4）：522-527.

［19］ Wakayama T， Yanagimachi R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type［J］. Mol Reprod Dev， 2001， 58（4）：376-383.

［20］ Kato Y， Tani T， Tsunoda Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult， newborn and fetal cows［J］. J Reprod Fertil， 2000， 120（2）：231-237.

［21］ Nagashima H， Fujimura T， Takahagi Y， et al. Development of efficient strategies for the production of genetically modified pigs［J］. Theriogenology， 2003， 59（1）：95-106.

［22］ Kou Z， Kang L， Yuan Y， et al. Mice cloned from induced pluripotent stem cells（iPSCs）［J］. Biol Reprod， 2010， 83（2）：238-243.

［23］ Zhou S， Ding C， Zhao X， et al. Successful generation of cloned mice using nuclear transfer from induced pluripotent stem cells［J］. Cell Res， 2010， 20（7）：850-853.

［24］ Fan N， Chen J， Shang Z， et al. Piglets cloned from induced pluripotent stem cells［J］. Cell Res， 2013， 23（1）：162-166.

［25］ Lee GS， Hyun SH， Kim HS， et al. Improvement of a porcine somatic cell nuclear transfer technique by optimizing donor cell and recipient oocyte preparations［J］. Theriogenology， 2003， 59（9）：1949-1957.

［26］ Schoevers EJ， Bevers MM， Roelen BA， et al. Nuclear and cytoplasmic maturation of sow oocytes are not synchronized by specific meiotic inhibition with roscovitine during in vitro maturation［J］. Theriogenology， 2005， 63（4）：1111-1130.

［27］ Swain JE， Bormann CL， Krisher RL. Development and viability ofin vitro derived porcine blastocysts cultured in NCSU23 and G1. 2/G2. 2 sequential medium［J］. Theriogenology， 2001， 56（3）：459-469.

［28］ Rath D， Niemann H， Torres CR. In vitro development to blastocysts of early porcine embryos produced in vivo or in vitro［J］. Theriogenology， 1995， 43（5）：913-926.

［29］ Wei HX， Zhang K， Ma YF， et al. Stage-dependent effect of leptin on development of porcine embryos derived from parthenogenetic activation and transgenic somatic cell nuclear transfer［J］. J Reprod Dev， 2009， 55（2）：99-104.

［30］ Tao T， Machaty Z， Boquest AC， et al. Development of pig embryos reconstructed by microinjection of cultured fetal fibroblast cells into in vitro matured oocytes［J］. Anim Reprod Sci， 1999， 56（2）：133-141.

［31］ Miyoshi K， Taguchi Y， Sendai Y， et al. Establishment of a porcine cell line from in vitro-produced blastocysts and transfer of the cells into enucleated oocytes［J］. Biol Reprod， 2000， 62（6）：1640-1646.

［32］ Kuhholzer B， Hawley RJ， Lai L， et al. Clonal lines of transgenic fibroblast cells derived from the same fetus result in different development when used for nuclear transfer in pigs［J］. Biol Reprod， 2001， 64（6）：1695-1698.

［33］ 潘偉榮， 魏太云， 信吉閣， 等. 電激活參數(shù)和培養(yǎng)基對豬卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011， 37（4）：415-418.

［34］ Zhang TY， Dai JJ， Wu CF， et al. Positive effects of treatment of donor cells with aphidicolin on the preimplantation development of somatic cell nuclear transfer embryos in Chinese Bama mini-pig（Sus scrofa）［J］. Anim Sci J， 2012， 83（2）：103-110.

［35］ Vajta G， Zhang Y， Machaty Z. Somatic cell nuclear transfer in pigs：recent achievements and future possibilities［J］. Reprod Fertil Dev， 2007， 19（2）：403-423.

［36］ Zhang Y， Li J， Villemoes K， et al. An epigenetic modifier results in improved in vitro blastocyst production after somatic cell nuclear transfer［J］. Cloning Stem Cells， 2007， 9（3）：357-363.

［37］ Zhao J， Ross JW， Hao Y， et al. Significant improvement in cloning efficiency of an inbred miniature pig by histone deacetylase inhibitor treatment after somatic cell nuclear transfer［J］. Biol Reprod， 2009， 81（3）：525-530.

［38］ Hammer RE， Pursel VG， Rexroad CE， Jr. ， et al. Production of transgenic rabbits， sheep and pigs by microinjection［J］. Nature，1985， 315（6021）：680-683.

［39］ Rogers CS， Stoltz DA， Meyerholz DK， et al. Disruption of the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in newborn pigs［J］. Science， 2008， 321（5897）：1837-1841.

［40］ Huang L， Fan N， Cai J， et al. Establishment of a porcine Oct-4 promoter-driven EGFP reporter system for monitoring pluripotency of porcine stem cells［J］. Cell Reprogram， 2011， 13（2）：93-98.

［41］ Yang D， Yang H， Li W， et al. Generation of PPARgamma monoallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning［J］. Cell Res， 2011， 21（6）：979-982.

［42］ CarlsonDF， Tana WF， Lillicod SG， et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（43）：17382-17387.

［43］ Zhou X， Xin J， Fan N， et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated gene-targeted pigs via somatic cell nuclear transfer［J］. Cell Mol Life Sci， 2015， 72（6）：1175-1184.

［44］ Yan Q， Yang H， Yang D， et al. Production of transgenic pigs overexpressing the antiviral gene Mx1［J］. Cell Regeneration， 2014，3（1）：11.

［45］ 李紫聰， 黃曉靈， 劉德武， 等. 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器研究進(jìn)展［J］. 廣東畜牧獸醫(yī)科技， 2013， 38（4）：1-5.

［46］ Prather RS， Hawley RJ， Carter DB， et al. Transgenic swine for biomedicine and agriculture［J］. Theriogenology， 2003， 59（1）：115-123.

［47］ Yang YG， Sykes M. Xenotransplantation：current status and a perspective on the future［J］. Nat Rev Immunol， 2007， 7（7）：519-531.

［48］ Matsunari H， Nagashima H. Application of genetically modified and cloned pigs in translational research［J］. J Reprod Dev， 2009， 55 （3）：225-230.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Technology of Pig Somatic Cell Nuclear Transfer

ZHANG Hong-yan1XIN Ji-ge1，2
（1. Animal Science and Technology College，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201；2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province，Kunming 650201）

The technology of pig somatic cell nuclear transfer has been developed for more than ten years，with gradual improvement of the technology，the cloned piglets and genetically modified piglets were generated in many laboratories. Recently，several effective gene targeting and regulating tools have developed quickly，which provides technology basis for the establishment of genetic modified pig models and promotes the transition of the related researches from basic to application. In this paper，its development process and the optimization of key procedures were introduced. The technical advantage，its applications and significances in agriculture and biomedicine were summarized. Meanwhile existing issues and applying prospects were discussed.

somatic cell nuclear transfer；pig；genetically modified；transfer genetic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.008

2015-05-31

國家自然科學(xué)基金項目（31360532），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（2013FB041），校博士科研啟動基金項目（2002374）

張宏燕，女，碩士研究生，研究方向：轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全評價；E-mail：2579647466@qq.com

信吉閣，女，博士，講師，研究方向：現(xiàn)代生物技術(shù)；E-mail：synlelovely@163.com