多房棘球蚴抗原蛋白TSP3抗原表位的生物信息學預測#

龐明泉，湯 鋒，周 虎，萬陳飛，陽丹才讓，4*，樊海寧，4**

(1.青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心，青海 西寧 810001；3.青海大學高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001；4.青海省包蟲病研究重點實驗室，青海 西寧 810001)

多房棘球蚴抗原蛋白TSP3抗原表位的生物信息學預測#

龐明泉1，3，湯 鋒2，3，4，周 虎1，3，萬陳飛1，3，陽丹才讓1，3，4*，樊海寧1，3，4**

(1.青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心，青海 西寧 810001；3.青海大學高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001；4.青海省包蟲病研究重點實驗室，青海 西寧 810001)

目的 預測多房棘球絳蟲抗原蛋白TSP3的二級結構和優(yōu)勢抗原表位(T細胞和B細胞表位)。方法 Genbank獲取TSP3的氨基酸序列后通過生物信息學軟件SOPMA預測二級結構特征，進一步通過在線軟件IEDB、SYFPEITHI、Bcepred和ABCpred預測TSP3的T細胞和B細胞表位。同時對TSP3的親水性、柔韌性、抗原性及蛋白表面暴露區(qū)域的特征進行預測。結果 無規(guī)則卷曲和β轉角分別占TSP3蛋白質的二級結構的25.68%和4.05%，說明潛在優(yōu)勢抗原性表位存在。通過多種生物信息學方法分析出TSP3潛在的T細胞表位為T33-42、T45-55、T53-63、T68-77、T80-90、T92-104、T110-122、T134-144；TSP3潛在的B細胞表位為T18-33、T45-55、T53-63、T64-75、T80-90、T92-104、T110-122。結論 TSP3的二級結構特征顯示潛在優(yōu)勢抗原性表位存在，預測出8種T細胞抗原表位和7種B細胞抗原表位，為后續(xù)表位疫苗的設計奠定了理論基礎。

多房棘球蚴 TSP3 生物信息學 二級結構 抗原表位

據(jù)報道，用重組蛋白疫苗免疫細粒棘球絳蟲的中間宿主，免疫作用可達95%～100%。因此，免疫預防為預防包蟲病疫情的有效措施[1]。表位(抗原決定簇)是決定抗原的特異性的化學基團，可分為T或(和)B細胞表位[2，3]，分別與T細胞抗原受體TCR或(和)B細胞抗原受體BCR特異性結合，最終刺激機體產(chǎn)生免疫反應，形成對病原微生物的免疫能力。目前表位疫苗已被應用于抗細菌[4，5]、病毒等感染與抗腫瘤中[6]，相比較于傳統(tǒng)疫苗，表位疫苗更為安全、無毒、穩(wěn)定，可以直接刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應，因此表位疫苗更符合未來疫苗的發(fā)展方向，在免疫預防中的作用越來越重要[7]。基于此，研制多房棘球蚴表位疫苗可為治療和預防多房棘球蚴病的發(fā)生提供新的有效方法。

表位疫苗的研發(fā)的最大難點在于尋找具有良好免疫原性的抗原位點[8]。Pfaff等[9]證明了146-154氨基酸(AA)和200-213a氨基酸多肽含有抗口蹄疫病毒(FMDV)的表位，這些表位肽可為表位疫苗的制備提供基礎。此外，Kouguchi等[10]研究顯示Emy162重組抗原可對大鼠產(chǎn)生74.3%的免疫保護作用。Sugimoto C[11]在2009年報道稱棘球蚴表面抗原TSP家族具有良好的免疫原性。Oku Y課題組[12]在2012年報道稱TSP家族中TSP-3是該家族中針對棘球蚴感染免疫原性最好的蛋白，認為FBP融合表達TSP3可以增強TSP-3的免疫原性從而更好地預防棘球蚴感染[13]。這些結果表明，通過分子疫苗來預防包蟲病是可行的。

本研究擬利用生物信息學軟件來預測和分析TSP3的二級結構特征，進一步預測潛在的T細胞抗原表位和B細胞優(yōu)勢抗原表位，為后續(xù)基于TSP3蛋白的表位疫苗的設計奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 獲取TSP3蛋白的氨基酸序列

從GenBank中(GenBank no.ACJ02404.1；http：//www.ncbi.nih.gov/ genbank/)獲得TSP3的核苷序列及相應的氨基酸序列。根據(jù)GenBank記錄，TSP3 蛋白由148個氨基酸組成，由447 bp 的mRNA編碼而成。氨基酸序列見圖1。

圖1 TSP3蛋白的氨基酸序列

Figure 1 Amino acid sequence of the TSP3 protein. The protein is composed of 148 amino acid residues

1.2 預測TSP3蛋白質的二級結構特征

用生物信息學軟件SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_a-utomat.plpage=/NPSA/npsa_sopma.html)[14]分析TSP3蛋白質序列的二級結構。輸入前述TSP3蛋白的氨基酸序列，對蛋白質二級結構的四個構象狀態(tài)—螺旋、折疊、轉角和卷曲分別進行分析。相似性閾值和窗口寬度的參數(shù)分別設置為8和17，余參數(shù)為默認值。

1.3 預測TSP3蛋白的T細胞抗原表位

在明確了TSP3的二級結構后，采用生物信息學軟件IEDB(http：//tools.immuneepitope.org/main/index.html)[15]和Syfpeithi(http：//www.syfpeithi.de)分析人源MHC1抗原HLA-A*02：01以預測分析潛在的T細胞抗原表位。將前述TSP3蛋白的氨基酸序列輸入，并且調(diào)整參數(shù)如下：“MHC allele(s)”設定為HLA-A *02：01，“l(fā)ength”設定為8、9、10，余參數(shù)不變。

1.4 預測TSP3蛋白的B細胞抗原表位

采用生物信息學軟件Bcepred(http：//www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html)和ABCpred(http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)[16]分析TSP3潛在的B細胞抗原表位。將前述TSP3蛋白質的氨基酸序列輸入，然后設置Bcepred參數(shù)值：親水性為2；靈活性為1.9；暴露的表面積為2.4；抗原性傾向為1.8，余參數(shù)不變。設置ABCpred軟件的抗原表位長度為10～16，余參數(shù)不變。

2 結果

2.1 預測的TSP3蛋白質二級結構

為了評價TSP3蛋白的抗原特性，我們使用在線生物信息學軟件SOPMA預測其二級結構。蛋白質中的延伸鏈和無規(guī)則卷曲結構部分最有可能出現(xiàn)潛在的優(yōu)勢抗原表位。預測的二級結構特征見圖2。分析結果顯示，TSP3二級結構的無規(guī)則卷曲、β轉角、α螺旋和延伸鏈(β折疊)的比例分別為25.68%、4.05%、60.81%、9.46%。

Parameters：Window width：17 Similarity threshold：8 Number of states：4

不同顏色的線代表不同的二級結構：藍色，α螺旋；綠色，β轉角；紅色，延伸鏈；紫色，無規(guī)卷曲.在蛋白質延長鏈和無規(guī)則卷曲有利于形成抗原表位

Lines in different colors represent different secondary structures：Blue，αhelix；green，β turn；red，extended strand；and purple，random coil.An increased numberof extended strands and random coils in the protein corresponded with an increased likelihood of the protein forming an antigenic epitope

圖2 TSP3蛋白的二級結構預測分析圖

Figure 2 Secondary structure prediction results for the TSP3 protein

2.2 預測所得TSP3蛋白的T細胞抗原表位

確定抗原表位的精確位置對于研發(fā)表位疫苗非常重要。在本研究中，MHC-I 型HLA-A*02：01限制性T細胞表位使用兩種在線軟件—IEDB和SYFPEITHI進行T細胞表位預測。通過不同位點區(qū)域的分值高低表示所預測的T細胞表位概率大小，在分配給該區(qū)域的分數(shù)越高，則該區(qū)域為抗原表位的可能性越大。雖然這兩個預測軟件采用的評分系統(tǒng)不同，但共同處是分值較高的位點區(qū)域即為被預測的潛在抗原表位。用IEDB軟件預測分較高的T細胞表位為T29-40、T37-48、T53-64、T66-77、T81-92(表1)。而SYFPEITHI軟件預測的相對優(yōu)勢的表位位于T118-126、T114-122、T55-63、T121-129(表2)。將兩軟件預測結果組合，并結合前述TSP3的蛋白二級結構特征，我們最終確定的8個T細胞潛在優(yōu)勢抗原表位為T33-42、T45-55、T53-63、T68-77、T80-90、T92-104、T110-122、T134-144。

表1 生物信息學軟件IEDB預測的TSP3的T細胞抗原表位

Table 1 Analysis of the T cell epitopes of TSP3 protein using IEDB online prediction software.

表2 生物信息學軟件SYFPEITHI預測的TSP3的T細胞抗原表位

Table 2 Analysis of the T cell epitopes of TSP3 protein using Syfpeithi online prediction software.

2.3 預測所得TSP3抗原的B細胞表位

B細胞表位使用Bcepred在線軟件預測，對TSP3的氨基酸序列的親水性、彈性、抗原傾向和抗原的暴露表面面積進行分析。預測分析結果見圖3，預測分析出TSP3蛋白的有高親水性的4個區(qū)域(見圖3A)是T35-41(氨基酸序列：GKEMQRE)、T48-55(氨基酸序列：HGRNASDP)、T85-97(氨基酸序列：SCCKSGKENCTQP)、T108-114(氨基酸序列：EQIKDSS)；預測出的2個彈性區(qū)域(圖3B)是T46-52(氨基酸序列：TAHGRNA)、T84-92(氨基酸序列：ASCCKSGKE)；4個可能的抗原區(qū)域(圖3C)是T16-36(氨基酸序列：EIVCGIVLLVYRHEFVGLVGK)、T55-75(氨基酸序列：PLLKSIYKLQEELECCGGVGP)、T117-130(氨基酸序列：FGLIILIVCLIQIG)、T132-138(氨基酸序列：VICACCL)；3個暴露的表面區(qū)域(圖3D)是T35-45(氨基酸序列：GKEMQREIKDL)、T62-68(氨基酸序列：KLQEELE)、T139-148(氨基酸序列：AKKVNEYEKV)。為了進一步準確預測出潛在的表位，我們同時通過在線軟件ABCpred預測，高分的地區(qū)是T59-73、T39-54、T80-95、T74-87、T129-144(表3)。結合TSP3蛋白的二級結構特征及兩種預測方法的綜合結果，所預測的潛在優(yōu)勢B細胞表位為T18-33、T45-55、T53-63、T64-75、T80-90、T92-104、T110-122。

A親水性，B彈性，C抗原傾向性、D抗原的暴露表面面積
Predictions of(A)hydrophilicity，(B)flexibility，(C)antigenic propensity，(D)exposed surface

圖3 生物信息學軟Bcepred預測的TSP3的B細胞抗原表位圖

Figure 3 B cell epitope prediction results for the TSP3 protein

表3 生物信息學軟ABCpred預測的TSP3的B細胞抗原表位

Table 3 Analysis of the B cell epitopes of TSP3 protein using ABCpred online prediction software

3 討論

表位疫苗制備中的首要難題是獲得有關表位的必要信息。

近年來，隨著生物信息學的發(fā)展，表位預測的操作簡便性和準確性有了較大提高，其在各項研究中的意義受到越來越多人的重視。馬秀敏等[17]以Eg的AgB1基因序列為基礎，首先用軟件PredictProtein預測了AgB1抗原蛋白的二級結構；應用Bcepred、Abcpred、IEDB及SYFPEITHI四種軟件預測出了4個B表位及4個T表位。李玲玲等人[18]根據(jù)EB病毒核蛋白-1(EBNA-1)的基因序列，使用SOPMA、GOR、HNN三種軟件對EBNA-1的B細胞優(yōu)勢表位進行了預測，并對跨膜結構域以及各種參數(shù)(如親水性)進行了分析。進而使用blastp對EBNA-1預測的B細胞表位的序列和人類的自身相關抗原的序列進行對比分析。

蛋白質的二級結構與其表位的分布密切相關，親水性和抗原性是表位形成的最主要因素，但柔軟性、暴露的表面區(qū)域和二級結構的構象在表位形成中也很重要。因此，我們分析了TSP3蛋白的二級結構以獲得該蛋白質的抗原特性。機體存在T細胞免疫和B細胞免疫以徹底消除抗原，因此本研究中我們使用多種方法、設置多種參數(shù)對TSP3的B細胞表位和T細胞表位進行預測分析。通過對TSP3蛋白的多種性質采用不同算法進行綜合分析，以提高所預測的抗原表位的準確性和特異性。

α螺旋和β折疊在維持蛋白質的二級結構穩(wěn)定中起重要作用，但α螺旋和β折疊通常位于該蛋白質的內(nèi)部，因此與配體結合相對困難。與此相反，β轉角和無規(guī)卷曲位于蛋白質的表面，容易與配體結合，因而β轉角和無規(guī)卷曲所在的氨基酸序列出現(xiàn)抗原表位的幾率較大。

通過SOPMA服務器軟件分析，α螺旋和β折疊的比例分別為60.81%、9.46%，表明TSP3抗原具有良好的穩(wěn)定性。有利于形成抗原表位的無規(guī)則卷曲和β轉角分別占蛋白質的25.68%和4.05%。TSP3有6個潛在的抗原區(qū)域，其中無規(guī)則卷曲區(qū)域在47-54(氨基酸序列：AHGRNASD)和72-99(氨基酸序列：GVGPTDWSKPYPASCCKSGKENCTQPYQ)比例較高，顯示這兩個區(qū)域具有較強的抗原性。

MHC-I型的表位在預測的T細胞表位中的預測準確率高達90%[19]。在中國人群，HLA-A *02：01是最常見的HLA-I類分子，呈55%的陽性率。因此，在本研究中，TSP3抗原的HLA-A *02：01限制性表位使用IEDB和SYFPEITHI在線軟件進行分析。根據(jù)兩種軟件及二級結構的綜合預測結果，被預測的TSP3蛋白的8個T細胞表位位于T33-42、T45-55、T53-63、T68-77、T80-90、T92-104、T110-122、T134-144。

我們采用多種方法和多種參數(shù)分析TSP3蛋白的B細胞表位，以提高預測的準確度。親水性參數(shù)的預測反映了親水性殘基在整個抗原氨基酸序列中的位置。該蛋白質的氨基酸殘基可被分為兩種類型：親水殘基和疏水殘基。一般情況下，疏水殘基位于蛋白質的內(nèi)部，而親水殘基位于蛋白的表面上。蛋白質的這個構象是有利的親水性殘基結合溶液中的極性分子，以中和蛋白質本身的電荷，從而使蛋白質保持最小能量的狀態(tài)。因此，親水性區(qū)域都與表位相關聯(lián)[20]。彈性參數(shù)反映出蛋白質的彎曲和折疊的能力。彈性程度增加，則蛋白質的多肽骨架具有較好的折疊和彎曲能力，便于二級結構構象的改變[21]。抗原傾向反映了抗原潛在的免疫原區(qū)，潛在的免疫原區(qū)最有可能出現(xiàn)具有抗原傾向的表位。對暴露的表面區(qū)域的分析反映殘基在蛋白質[22]的外層中的分布，增加了溶劑分子與蛋白接觸的幾率。應用兩個在線軟件對TSP3的表位參數(shù)綜合分析可預測B細胞表位。我們共預測分析出7個B細胞潛在優(yōu)勢抗原表位，分別為T18-33、T45-55、T53-63、T64-75、T80-90、T92-104、T110-122。

本研究的目的是為了獲得TSP3蛋白的生物信息學特性。生物信息學軟件SOPMA被用來預測TSP3蛋白的二級結構，通過生物信息學軟件IEDB和SYFPEITHI預測分析T細胞抗原表位，B細胞表位則通過生物信息學軟件Bcepred和ABCpred綜合預測分析而得。TSP3預測的二級結構表明，TSP3存在形成抗原表位的結構區(qū)域。T細胞表位和B細胞表位預測結果表明，T細胞表位位于T33-42、T45-55、T53-63、T68-77、T80-90、T92-104、T110-122、T134-144；B細胞表位位于T18-33、T45-55、T53-63、T64-75、T80-90、T92-104、T110-122。并且存在T45-55、T53-63、T80-90、T92-104、T110-122五個同時有B/T雙細胞性的表位。

本研究為TSP3蛋白優(yōu)勢表位的鑒定和篩選提供了基礎，并為免疫預防和治療多房棘球蚴病的表位疫苗研發(fā)奠定了理論基礎。

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Bioinformatic prediction of epitopes in the TSP3 antigen ofEchinococcusmultilocularis

Pang Mingquan1，3，Tang Feng2，3，4，Zhou Hu1，3，Wan Chenfei1，3，Yangdan Cairang1，3，4*，F(xiàn)an Haining1，3，4**

(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001；2.Research Center for High Altitude Medical Sciences，Qinghai University School of Medicine，Xining，Qinghai 810001；3.Research Institute for High Altitude Zoonosis of Qinghai University；
4.Qinghai Provincial Key Laboratory for hydatid，Xining，Qinghai 810001)

Objective The present study aims to predict the secondary structure and the T-and B-cell epitopes for theEchinococcusmultilocularisTSP3 antigen，in order to reveal the dominant epitopes of the antigen.Methods The secondary structure of the protein was analyzed using SOPMA server.The T-cell and B-cell epitopes of TSP3 were predicted using IEDB，Syfpeithi，Bcepred and ABCpred online software.The characteristics of hydrophilicity， flexibility, antigenic propensity and exposed surface area were predicted.Results The random coils and β sheets accounted for 25.68% and 4.05% of the secondary structure of the TSP3 protein，respectively.This was indicative of the presence of potential dominant antigenic epitopes in TSP3.Following bioinformatic analysis，numerous distinct antigenic epitopes of TSP3 were identified.The high-scoring T-cell epitopes were located at positions T33-42，T45-55，T53-63，T68-77，T80-90，T92-104，T110-122 and T134-144；whilst the likely B-cell epitopes were located at positions T18-33，T45-55，T53-63，T64-75，T80-90，T92-104 and T110-122.Conclusions Eight T cell and seven B cell dominant epitopes of the TSP3 antigen were revealed by the bioinformatic methods，which may be useful for the development of a dominant epitope vaccine.

EchinococcusmultilocularisTSP3 Bioinformatics Secondary structure Epitopes

R392-3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.001

2015-09-03

#：青海省科技廳項目(編號：2014-ZJ-716)；青海大學中青年團隊項目(編號：2014-QYT-1)；

*：第一通訊作者，副教授，碩士研究生導師，yangdancairang@163.com；**：第二通訊作者，教授，博士研究生導師，fanhaining@medmail.com.cn.

龐明泉(1989～)，男，漢族，山東籍，在讀碩士，青海大學普通外科學專業(yè)