青海地區回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多態性研究*

沈國雙，鄭方超，趙久達

(青海大學附屬醫院，西寧 810001)

青海地區回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多態性研究*

沈國雙，鄭方超，趙久達※

(青海大學附屬醫院，西寧 810001)

目的 探討青海地區回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多態性。方法 采用1：1匹配病例對照研究。選取78例青海大學附屬醫院胃癌住院病例為病例組，按年齡、性別、民族匹配正常對照組。利用TanMan_MGB探針法對78例病例和78例對照進行PLCE1基因 rs3765524位點基因型檢測，比較、分析病例組和正常對照組間的該位點基因型頻率的分布差異。結果 PLCE1基因rs3765524位點基因型的分布頻率在病例組和正常對照組之間的差異無統計學意義(P=0.207，P=0.075)。結論 PLCE1基因rs3765524位點C>T的多態性改變與青海地區回族人群胃癌患病易感性之間無關聯。

胃癌 回族 PLCE1 基因單核苷酸多態性

第三次全國全死因調查結果顯示，青海省胃癌發病率高居全國第二位，尤其是藏族和回族人群胃癌發病率較高[1-2]。本研究擬對該地區特定民族胃癌高發的原因及發病機制進行相關研究。磷脂酶Cε1 (Phospholipase C epsilon-1， PLCE1)是近年來發現的磷酸酶C家族的一種同工酶、癌基因，位于人第10號染色體長臂2區3帶(10q23)，其能夠激活IP3/Ca2+、DG/PKC、EPK和MAPK等信號通路介導細胞信號傳導，參與細胞生長、分化、凋亡和血管生成等過程[3-4]。rs3765524定位于PLCE1基因第24個外顯子，其突變可導致第1 777位氨基酸編碼由蘇氨酸變為異亮氨酸(ACC1777ATC)[5]。近年來的研究發現，PLCE1基因rs3765524位點C>T的多態性改變與人群胃癌和食管癌的發病易感性顯著相關[6-9]。此外，本研究團隊早期發現青海地區漢、藏族人群胃癌患病易感性可能與PLCE1基因多態性有關[10]。考慮到種族及區域因素對遺傳背景的影響，本研究利用1：1匹配病例對照研究，探索PLCE1基因rs3765524位點C>T的多態性改變是否可以增加青海地區回族人群胃癌的患病風險，以期為該地區回族人群胃癌早期診斷和靶向治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇

從青海大學附屬醫院2010年10月至2011年10月間住院的胃癌患者中選取無血緣關系患者78例，年齡54.07±10.30歲，男性45(57.69%)例。所有胃癌患者要求世居青海，無與其他民族通婚情況，進行R0切除術后經組織病理學證實，且未進行新輔助放射治療和抗腫瘤藥物治療。78例正常對照者，為同時期世居青海、無與其他民族通婚史、無腫瘤病史，且其他條件匹配的病例組1：1匹配。

研究方案經青海大學附屬醫院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。由經過統一培訓的調查員，使用統一調查表對每個研究對象進行面訪，調查內容包括基本人口學資料及環境暴露史、H.pylori感染史及惡性腫瘤家族史等資料，并采集外周血5 mL。

1.2 PLCE1基因rs3765524位點基因分型

所有血樣標本添加EDTA-K2抗凝，分裝后行程序降溫，最終置-80 ℃冰箱內保存。采用全血DNA提取試劑盒(TianGen)按步驟提取，并純化全血基因組DNA。

根據NCBI數據庫報道人類PLCE基因DNA序列，利用Primer Premier 5軟件設計rs3765524位點PCR引物序列為：

上游5′CGTCTGTGTCGCAGGTATTCTC 3′，

下游5′GGGTTCGGGTTGGAAGAGTC 3′。

隨后在上海基康生物技術有限公司訂購Taqman-MGB探針，Probe1：FAM-AAACTGACCCAGCACA-MGB，Probe2：HEX-AAACTGATCCAGCACAC-MGB。PCR反應體系及擴增條件：PCR反應總體系為25 μL，含100 ng/mL DNA模板2 μL，10×緩沖液215 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L引物1 μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。反應在溫度梯度PCR儀 (美國ABI公司)進行，條件為：95 ℃變性 30 s，61 ℃退火40 s，72 ℃后延伸1 min，進行36個循環。最后，取PCR產物2 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增產物。

根據7900HT定量PCR儀(美國ABI公司)終點讀板法基因分型操作流程，利用定制的TaqMan-MGB探針對PLCE1基因rs3765524位點進行基因分型。此外，由于DNA數量和質量等原因，導致未能成功進行分型的標本則需重新進行分型。所有標本分型完成后，隨機抽取5%標本進行DNA測序驗證。

1.3H.pylori感染狀況檢查

采用14C-尿素呼氣試驗(14C-UBT)對上述研究樣本進行幽門螺桿菌(Hp)感染檢查。14C-UBT使用無效放射性的穩定同位素進行檢測，具有較高的敏感度(>95%)和特異度(>95%)，適用于各個年齡段人群H.pylori感染的診斷和治療后的復查。

1.4 統計學處理

應用SAS 9.1.3軟件，采用χ2檢驗方法或Fisher確切概率法，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料信息的比較分析

78例胃癌患者和78例正常對照按照年齡、性別和民族相同的條件進行1：1匹配。與正常對照人群相比，青海地區回族胃癌患者的吸煙史陽性(15.38%vs.34.62% )、腫瘤家族史陽性( 24.36%vs.61.54%)和H.pylori感染史陽性(33.33%vs.55.13%)人群的比例均顯著性升高，提示家族遺傳因素和H.pylori感染因素可能是胃癌發病的危險因子，詳見表1。

表1 病例組和正常對照組患者的一般信息(%)

Table 1 Comparison of general characteristics between cases and controls

2.2 PLCE1基因rs3765524位點基因型多態性分析

在78例正常對照人群中，PLCE1基因rs3765524位點CC、CT、和TT基因型分別占64.10%、34.61%和1.28%，T等位基因的頻率為0.19，且該位點T等位基因在正常對照中的分布符合Handy-Weinberg平衡(χ2=1.61，P=0.447)，提示對照組人群具有良好的代表性，詳見表2。此外，78例胃癌患者中CC、CT和TT的基因型頻率分別為50.00%、46.15%和3.85%，T等位基因的頻率為0.27，詳見表2。

表2 病例組和對照組中PLCE1基因rs3765524(C>T)位點基因頻率

Table 2 Distribution of genotypes of PLCE1 rs3765524(C>T)in cases and controls

2.3 PLCE1基因rs3765524位點基因型多態性與青海地區回族人群胃癌患病易感性的關系

PLCE1基因rs3765224位點基因型分布及其與青海地區回族人群胃癌患病易感性之間的關系詳見表2。如表所示，該位點基因型頻率在病例組和對照組之間的分布差異無統計學意義(P=0.207，P=0.075)。

3 討論

遺傳變異可通過影響基因的表達，導致蛋白質結構和功能發生改變，進而影響細胞信號傳導，改變細胞生命活動，引起細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等行為，最終引發腫瘤或其他疾病的發生[5]。許多報道結果表明[6，7，10]，PLCE1基因突變與胃癌患病易感性密切相關，然而PLCE1基因rs3765524位點單核苷酸多態性與胃癌之間關系的報道則相對較少。

本研究在前期研究的基礎上，利用匹配病例對照設計，在青海省回族人群中探討PLCE1基因rs3765524位點單核苷酸多態性與胃癌患病易感性之間的關系。結果證實，PLCE1基因rs3765524位點C>T的多態性改變并未顯著增加青海地區回族人群胃癌的患病風險。

PLCE1基因rs3765524位點單核苷酸多態性與胃癌患病風險之間的關聯，最早由Abnet等[6]人在中國太行山脈地區上消化道腫瘤高發區開展的全基因關聯研究中發現，其對2 240名胃腺癌患者和3 302名共同正常對照者進行分析，發現rs3765524位點C>T的多態性突變可以使該地區人群胃癌發病風險增加31%。隨后，Mou等[11]人在中國漢族人群中對200例胃癌患者和134名正常對照者的研究中進一步證實了rs3765524位點C>T的多態性改變與胃癌患病易感性之間的關聯。此外，梁平等[5]通過對西北地區476例胃癌患者和481例健康人群的研究，再一次證實PLCE1基因rs3765524位點C>T的多態性改變與我國西北漢族人群胃癌易感性顯著相關。

但是，本研究的結果與上述者的研究結果不同，究其原因可能如下：(1)所有納入分析的78例胃癌患者均未進行Lauren分型，繼而未進行深入分析，研究顯示[12]Lauren分型可以反映腫瘤的生物學行為，特別是在彌漫性胃癌患者中，其一般不伴萎縮性胃炎和胃黏膜上皮化生，且與個體的遺傳易感性密切相關。(2)本研究未考慮胃癌發生的部位，一般認為賁門癌和非賁門癌由于解剖位置的差異，導致其分子生物學特性也不同，提示胃癌的發生部位在胃癌的發生過程中起到重要作用。(3)本研究納入分析的樣本量較小，導致多因素分析時無法達到較高的檢驗功效進而掩蓋其真實的效應。因此，擴大樣本量，納入Lauren分型和胃癌發生部位信息，將有助于全面研究PLCE1基因rs3765524位點單核苷酸多態性與胃癌患病易感性之間的關聯。

此外，需要注意的是，胃癌是一種與H.pylori感染史密切相關的腫瘤，且這種關聯在大量研究已經得到確認[13-14]。然而本研究中，納入研究的人群中H.pylori感染的檢出率為44.23%，遠低于全國56.22%的平均檢出水平[15]，尤其是正常對照人群中，分析其原因可能與青海地區回族人群生活習慣以及納入研究病例數較少有關[16]。

綜上所述，本研究認為，在青海地區回族人群中PLCE1基因rs3765524位點C>T的多態性改變與該地區回族人群胃癌患病易感性之間無顯著性關聯，提示該位點基因型的多態性可能不是改變該地區回族人群胃癌患病易感性的遺傳因子。

此外，由于不同地域人群生活環境和遺傳背景存在差異，且本研究存在樣本量小、未進行Lauren分型和未考慮腫瘤發生部位等不足，因此本研究結論尚需大樣本研究確認。

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Polymorphisms of PLCE1 rs3765524 among Hui patients with gastric cancer in Qinghai area

Shen Guoshuang，Zheng Fangchao，Zhao jiuda

(Department of Breast and Thyroid Surgery，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai 810001)

Objective To explore the polymorphisms of PLCE1 rs3765524 among Hui patients with gastric cancer in Qinghai area.Methods 1：1 matched case-control study was conducted.78 patients with gastric cancer in Qinghai University Affiliated Hospital were recruited as case group，healthy controls were matched according to the same age，sex，and nationality.Genotypes of PLCE1 rs3765524 were detected using TapMan-MGB method among 78 gastric cancer cases and 78 matched healthy controls，then the difference in genotype frequencies of PLCE1 rs3765524 was analyzed between cases and controls.Results No significant difference in genotype frequencies of PLCE1 rs3765524 was observed between cases and controls，with P value being 0.207 or 0.075.Conclusions These findings suggest that the mutation from C to G of PLCE1 rs3765524 is not associated with Hui patients with gastric cancer in Qinghai area.

Gastric cancer Hui population PLCE1 Gene Polymorphism

*：青海省科技廳應用基礎研究計劃項目(2012-Z-739) 沈國雙(1976～)，男，土族，青海籍，碩士，副主任醫師

R394.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.006

2015-03-04

※：通訊作者，博士，Email_jiudazhao@126.com