多房棘球蚴重組蛋白CTB-Emy162的原核表達及分離純化#

周 虎，湯 鋒， 龐明泉，萬陳飛，樊海寧，4，陽丹才讓，4*，鄧 勇，4**

(1.青海大學附屬醫院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學醫學院高原醫學研究中心，青海 西寧 810001；3.青海大學高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001；4.青海省包蟲病研究重點實驗室)

多房棘球蚴重組蛋白CTB-Emy162的原核表達及分離純化#

周 虎1，3，湯 鋒2，3，4， 龐明泉1，3，萬陳飛1，3，樊海寧1，3，4，陽丹才讓1，3，4*，鄧 勇1，3，4**

(1.青海大學附屬醫院肝膽胰外科，青海 西寧 810001；2.青海大學醫學院高原醫學研究中心，青海 西寧 810001；3.青海大學高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001；4.青海省包蟲病研究重點實驗室)

目的 構建融合基因CTB-Emy162原核表達系統，純化得到多房棘球蚴重組蛋白CTB-Emy162。方法 根據多房棘球蚴抗原Emy162在GenBank中的序列，用生物信息學軟件OptimumTMCodon 優化密碼子適應指數(CAI)、最優密碼子頻率(FOP)及GC含量從而獲得適合大腸桿菌BL-21表達的Emy162基因序列。PCR擴增Emy162基因，定向在pET-28a-CTB的CTB基因5′端插入Emy162基因。構建CTB和Emy162雙基因原核表達質粒pET28a-CTB-Emy162，將該質粒轉化于E.coli BL-21(DE3)中，經IPTG誘導蛋白表達后，利用Ni-NTA 柱親和層析及離子交換色譜純化后獲得目的蛋白。結果 OptimumTMCodon 獲得優化后的Emy162序列，經生物公司測序及酶切鑒定結果證明重組質粒pET28a-CTB-Emy162構建成功，進一步實驗結果表明CTB-Emy162在原核表達系統pET-28a中主要以包涵體形式存在，在可溶部位少量表達。繼而經Ni-NTA柱親和純化及離子交換色譜純化獲得CTB-Emy162純蛋白。結論 以大腸桿菌E.coli BL-21(DE3)及pET-28a構成的原核表達系統能夠成功表達重組蛋白CTB-Emy162，Ni-NTA純化柱能夠純化目的蛋白CTB-Emy162。

多房棘球蚴 Emy162 原核表達系統

包蟲病(echinococcus)是一種人獸共患性寄生蟲病。目前外科手術和藥物治療雖是包蟲病治療的主要方案，但存在術后復發率高、藥物治療效果不理想的弊端[1]。疫苗預防相對于手術和藥物治療，是一種簡便、經濟而有效的防控措施。但包蟲病疫苗的研制極具挑戰性，主要表現在棘球蚴在體內寄生和進化，發育各階段產生的抗原不同，很難找到一個有效抗原，現有疫苗免疫效果不佳。

本研究選取的多房棘球蚴絳蟲表面抗原Emy162，是表達于多房棘球蚴絳蟲4個發育階段(原頭節，續絳期，幼蟲和成蟲)的基因序列[2]。Emy162抗原被證實具有抗多房棘球蚴感染作用且與細粒棘球蚴良好的免疫抗原Eg95具有類似的結構特征[3-6]。這一生物學特性可以為研制抗泡型和囊型包蟲病的疫苗提供可能。本實驗擬借助分子生物學技術優化Emy162的序列，并偶聯分子內黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞單位(CTB)[7-12]。為獲得重組蛋白CTB-Emy162，本研究構建適宜CTB-Emy162的表達的質粒載體，并在大腸桿菌E.coli BL-21(DE3)表達系統中表達，以獲得目的重組蛋白CTB-Emy162。為研究其作為抗棘球蚴病疫苗的價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-CTB-UE由寧夏醫科大學郭樂教授惠贈；原核表達載體pET-28a(E.coli)、BL21(DE3)株由北京康為世紀生物科技有限公司提供；限制性內切酶 KpnⅠ、XhoⅠ、Nco I、T4 DNA連接酶由Takara公司提供；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳DNA 純化回收試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供；Ni-NTA純化介質、基因序列的合成優化由南京金斯瑞公司提供并合成；卡納霉素(kana)由上海生物工程技術服務有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 Emy162序列的獲得及優化

從GenBank中獲得的目的基因Emy162氨基酸序列：1MVLRFCLILLATSVIAEEVGVDPELIAKLTKKLQTTLPEHFRWIHVGSRSLELGWNATGLANLHADHIKLTANLYTTYVSFRYRNVPIERQKLTLEGLKPSTFYEVVVQALKGDSEVYKYTGFIRTLAPGEDGADRAGGFALIFAMAGLLLLT153。在得到上述氨基酸序列的基礎上，使用生物信息學軟件OptimumTMCodon對目的序列進行優化設計，按照酶切位點對側翼序列的具體要求設計出包含相應酶切位點和保護性堿基的序列：

5′-ATGGTGCTGCGCTTTTGTCTGATCCTGCTGGCGACGAGTGTTATTGCGGAAGAAGTGGGCGTGGACCCGGAACTGATTGCTAAACTGACCAAAAAACTGCAGACCACGCTGCCGGAACATTTTCGTTGGATTCACGTCGGCAGCCGCTCTCTGGAACTGGGCTGGAACGCGACCGGTCTGGCCAATCTGCATGCAGATCACATTAAACTGACGGCCAACCTGTATACCACGTACGTGAGCTTCCGTTATCGCAATGTTCCGATCGAACGTCAGAAACTGACCCTGGAAGGTCTGAAACCGAGTACGTTTTACGAAGTGGTTGTCCAAGCGCTGAAAGGCGACTCCGAAGTGTATAAATACACCGGTTTCATTCGTACGCTGGCTCCGGGTGAAGATGGTGCAGACCGTGCTGGTGGTTTTGCGCTGATCTTCGCGATGGCCGGCCTGCTGCTGCTGACC-3′。優化后的序列委托南京金斯瑞生物科技公司進行上述目的基因的合成，并按照大腸桿菌密碼子偏愛性原則轉化成相應的核苷酸序列。

1.2.2 多房棘球蚴表面抗原Emy162的基因合成與擴增

將前期獲取的Emy162的氨基酸序列，委托南京金斯瑞生物科技公司將氨基酸序列轉化成相應的核苷酸序列并進行基因合成。合成后的Emy162進行PCR：40 μL PCR總體系中包括Emy162模板2 μL，Master mix 20 μL，Emy162引物2 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 sec，72 ℃退火30 sec，72 ℃延伸40 sec，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 pET28a-CTB-Emy162質粒載體的構建

通過質粒小量提取試劑盒(天根)提取質粒pET-CTB-UE，經Kpn I和Xho I在37 ℃下進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳DNA純化回收試劑盒回收pET-CTB表達載體。回收后的pET-CTB與Emy162經T4連接酶在冰箱(4℃)中過夜連接，構建表達載體pET28a-CTB-Emy162，并經Nco I和Xho I酶切鑒定。構建好的質粒轉入大腸桿菌BL-21中，涂布在含有kana抗生素的LB固體培養基上，過夜培養(37℃)。次日晨挑取陽性菌株測序。

1.2.4 CTB-Emy162蛋白的表達及純化

經酶切鑒定及測序100%比對成功菌株及陰性對照菌(pET-28a載體不含目的基因)在LB液體培養基中培養6 h，按1：100的比例接種于200 mL LB 液體培養基中，搖床(190r/min，37℃)培養；待LB液體培養基OD600值達到0.6～0.8時，加入異丙基-β-硫代半乳糖(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，至IPTG終濃度為0.1 mmol /L，搖床(190r/min，28℃)誘導培養過夜后，讓宿主菌體充分誘導表達蛋白，后經離心(10000r/min，20min)收集沉淀，用PBS混懸，冰上行細胞破碎(20min)，離心(12000r/min，20min)后分別取上清和沉淀；收集離心后的上清，離心后的沉淀用8M尿素超聲溶解，離心(12000r/min，10min)，取上清為包涵體部位蛋白溶液，行SDS-PAGE電泳確定目的蛋白表達的部位。在確定了重組蛋白表達部位后，使用Ni-NTA鎳柱親和層析純化目的蛋白，純化目的蛋白時使用8 M尿素咪唑梯度(20、50、100、250mm/L咪唑)洗脫，收集各梯度洗脫液。將純化后的蛋白(250mm/L咪唑洗脫溶液)溶液裝入激活后的透析袋中，分別用含6、4、2、0 M尿素的PBS 梯度溶液放置于冰箱(4℃)中透析，每隔12 h更換1次梯度液(期間需輕輕搖晃以加快透析)，共透析48 h；透析完成，將溶液離心(12000r/min，15min)，收集上清。用聚乙二醇20000(PEG20000)濃縮已得到的純化蛋白，-80 ℃保存。

2 結果

2.1 Emy162序列的優化

利用生物信息學軟件OptimumTMCodon對Emy162序列進行優化，優化內容主要針對FOP、CAI及GC含量進行調整。如圖1所示，CAI優化前為0.55(圖1A)，優化后為0.90(圖1B)；FOP優化見圖1C、D，優化后FOP為74；繼而對優化前后序列的GC含量進行考察，如圖1E、F所示：優化前GC含量為46.51，優化后為53.35。優化后的Emy162序列達到大腸桿菌密碼子偏愛性的最優狀態序列：ATGGTGCTGCGCTTTTGTCTGATCCTGCTGGCGACGAGTGTTATTGCGGAAGAAGTGGGCGTGGACCCGGAACTGATTGCTAAACTGACCAAAAAACTGCAGACCACGCTGCCGGAACATTTTCGTTGGATTCACGTCGGCAGCCGCTCTCTGGAACTGGGCTGGAACGCGACCGGTCTGGCCAATCTGCATGCAGATCACATTAAACTGACGGCCAACCTGTATACCACGTACGTGAGCTTCCGTTATCGCAATGTTCCGATCGAACGTCAGAAACTGACCCTGGAAGGTCTGAAACCGAGTACGTTTTACGAAGTGGTTGTCCAAGCGCTGAAAGGCGACTCCGAAGTGTATAAATACACCGGTTTCATTCGTACGCTGGCTCCGGGTGAAGATGGTGCAGACCGTGCTGGTGGTTTTGCGCTGATCTTCGCGATGGCCGGCCTGCTGCTGCTGACC。

2.2 Emy162基因的cDNA序列的擴增

Emy162基因的PCR 擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳(100V，30min)。經SYBR Green I染色，觀察電泳結果，在約459 bp處出現特異性 DNA 擴增條帶，其大小與理論推算一致，見圖2。

2.3 表達載體pET28a-CTB-Emy162的鑒定

經T4連接酶體系連接將Emy162插入原核表達載體pET28a-CTB，并將重組質粒載體命名為pET28a-CTB-Emy162，其結構示意圖(圖3)可見其含有三個酶切位點，為目的DNA 的插入和酶切鑒定提供相應的酶切位點。表達載體pET28a-CTB-Emy162經限制性內切酶NcoI、XhoI雙酶切后，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析發現，在790 bp大小左右有目的條帶(圖4)。表明原核表達載體pET28a-CTB中成功插入790 bp的基因序列。繼而經測序驗證發現該790 bp序列與CTB-Emy162完全吻合，無堿基錯配及偏移等情況(圖5)。

2.4 pET28a-CTB-Emy162的原核表達及蛋白表達部位的鑒定

pET-CTB-Emy162經IPTG誘導后，菌液上清即含分泌性蛋白，菌體經超聲破碎離心后，收集可溶性及包涵體蛋白。收集液分別行SDS-PAGE電泳檢測。電泳結果如下(圖6A)，可見在包涵體部位33 kD見明顯擴增條帶，而在可溶部位僅有微弱表達。上述實驗結果證明，原核表達載體pET-28a能夠成功表達重組蛋白CTB-Emy162，且重組蛋白CTB-Emy162在原核表達載體pET-28a中是以包涵體形式表達。

A：優化前密碼子適應指數； B：優化后密碼子適應指數； C：優化前最優密碼子頻率； D：優化后最優密碼子頻率；E：優化前GC含量； F：優化后GC含量

A1：D2000 Plus DNA Ladder； 2：PCR 擴增得到Emy162基因的cDNA序列(459bp)

圖3 重組質粒pET-CTB-Emy162結構示意圖

1：Maker； 2：pET-CTB-Emy162經Nco I /Xho I雙酶切

圖5 重組質粒pET-CTB- Emy162測序結果比對圖

A1：pET-28a全菌蛋白(陰性對照)； 2：pET28a-CTB-Emy162全菌蛋白； 3：pET28a- CTB-Emy162可溶蛋白；4：包涵體蛋白.B1：包涵體蛋白；2：純化CTB-Emy162蛋白

2.5 pET-CTB-Emy162的純化結果

本研究證實，目的蛋白CTB-Emy162在細菌的包涵體部位表達，將收集的pET-CTB-Emy162包涵體溶液經Ni-NTA離子層析純化，經復性后獲得純化后的蛋白CTB-Emy162，行SDS-PAGE觀察純化后的效果見圖6B，可見經純化后的目的蛋白CTB-Emy162在33 kD有一條明顯增粗的條帶，實際大小與理論值相符。本實驗表明，利用pET-28a原核表達載體表達的重組蛋白CTB-Emy162經純化后基本能達到電泳純的級別。

3 討論

大腸桿菌表達系統應用歷史悠久。1977年，利用大腸桿菌表達系統成功表達出人生長激素[13]。現如今，借助大腸桿菌作為工程菌表達生產的蛋白約占現有重組蛋白藥物的三分之一[14]。大腸桿菌表達系統作為典型的原核表達系統之一，主要由表達載體、外源基因(目的基因)、表達宿主菌三部分組成[15，16]。由于其遺傳背景清楚、培養簡單、轉化及轉導效率高、實驗成本較為低廉，并可快速量產目的蛋白等優點，現已成為應用最為廣泛的原核表達系統[17，18]。此外，pET系列原核表達載體是美國Novagen公司設計推廣的大腸桿菌高效表達系統，pET系列原核表達體系利用IPTG誘導啟動子來過量表達T7 RNA聚合酶，繼而使得宿主菌表達大量的目的蛋白[19]。

根據目的蛋白在宿主菌中表達的部位不同，可將目的蛋白的原核表達分為胞外、周質、胞質表達三種形式。其中，胞外表達目的蛋白主要被分泌到宿主菌的培養基中，故容易純化且有活性。周質表達也稱可溶性表達，蛋白主要存在周漿間隙中，目的蛋白是否有活性，主要受自身結構和誘導溫度、滲透壓、pH等外界環境影響[20]。胞質表達即以包涵體形式表達，其目的蛋白量雖較前兩者而言最高，但由于目的蛋白易形成無活性的包涵體，需經變性復性才能得到有活性的目的蛋白[21，22]。

此外，以pET-28a為載體表達的蛋白多以包涵體形式存在，這可能是由于細胞內蛋白酶降解，宿主菌代謝負荷過大使得表達產物不能形成有活性的天然構象導致的[23]。實驗結果中發現可溶部位少量表達，其原因可能是：(1)誘導表達的溫度過低，宿主菌生長速度減慢，蛋白結構折疊正確，相應增加分泌性蛋白的表達；(2)誘導蛋白過度表達，可能改變了大腸桿菌還原性的胞質環境，從而形成較多的二硫鍵，促進可溶性表達；(3)連接體(Linker)有可能影響了蛋白序列，進而改善蛋白折疊，增加可溶蛋白的表達；(4)可溶部位蛋白超聲時間過長，少量包涵體破碎，目的蛋白釋放；(5)其他原因，包括IPTG濃度、培養液的pH影響等。

蛋白純化的原理主要利用不同蛋白間存在的差異性，這種差異主要表現蛋白的大小上，蛋白的大小影響著該蛋白所帶的電荷大小。此外，蛋白的疏水性、溶解度和生物學活性等也影響著蛋白的純化。正是由于這種不同蛋白質之間存在差異，才可以將目的蛋白從其他蛋白中純化出來[24]。本實驗中，在構建重組蛋白CTB-Emy162表達載體時，選擇的質粒載體為C末端帶有6個組氨酸標簽的pET-28a。這種質粒載體表達蛋白的產量高，但表達的蛋白因不能形成正確的空間結構，而以包涵體的形式存在。此外，pET-28a攜帶的組氨酸是具有雜環的氨基酸，每個組氨酸含有一個咪唑基團(帶有很多額外電子)，對于帶正電的化學物質(蛋白)有靜電引力。組氨酸標簽在pH為8.0時不帶電，且無免疫原性，對蛋白質的表達、結構折疊及功能的影響極小，且能高度親和鎳離子。鎳柱親和層析正是利用這一原理將帶有組氨酸的蛋白吸附掛柱。因此選擇帶有組氨酸標簽的pET-28a作為質粒載體，不僅可以提高蛋白產量，也可以為后期目的蛋白的純化做好鋪墊。

本研究是在獲得多房棘球蚴表面抗原Emy162的基礎上，利用生物信息學軟件OptimumTMCodon對其CAI、FOP及GC含量及編碼的序列進行合理優化，以獲取適合大腸桿菌表達的基因，并插入免疫佐劑載體CTB基因，以增強蛋白的免疫效果。本實驗將重組序列CTB-Emy162成功轉入原核表達載體pET-28a，并經酶切、測序確證，后經蛋白表達、純化、表達部位鑒定等，證實pET-28a能夠作為CTB-Emy162的表達載體，且在包涵體部位高量表達。CTB-Emy162經純化復性后獲得可用于后續實驗的電泳純蛋白。

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Prokaryotic expression and purification of recombinant protein CTB-Emy162 inEchinococcusmultilocularis

Zhou Hu1，3，Tang Feng2，3，Pang Mingquan1，3，Wan Chenfei1，3，Fan Haining1，3，Yangdan Cairang1，3*，Deng Yong1，3**

(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001；2.Research Center for High Altitude Medical Sciences，Qinghai University School of Medicine，Xining，Qinghai 810001 3.Research Institute for High Altitude Zoonosis of Qinghai University)

Objective Constructed a prokaryotic expression system for CTB-Emy162 and obtained Purified fusion proteinCTB-Emy162 inEchinococcusmultilocularis.Method According to the sequence ofEchinococcusmultilocularisEmy162 antigen in GenBank，Bioinformatics software OptimumTMCodon was used to obtain a suitable sequence of gene expressed in E.coli BL-21 by optimizing of codon adaptation index(CAI).The optimal codon fre-quency(FOP)and the content of GC.and the optimization sequence were cloned into prokaryotic expression vector and pET-28a.IPTG induction，Ni-NTA affinity chromatography and ion exchange chromatogra-phy were utilized to obtain CTB-Emy162 protein.Results Emy162 sequencewe procured was suitable for prokaryotic expression system by OptimumTMCodon software.Recombinant plasmids pET28a-CTB-Emy162 were constructed successfully and identified by double-enzyme digestion and sequencing.Further，our results were indicated that CTB-Emy162 was expressed in inclusion bodies part of pET28a-CTB-Emy162.Finally，we obtained highly purified recombinant protein CTB-Emy162 by Ni-chelating affinity chromatography.Conclusions In this study，we successfully establish the prokaryotic expression system of CTB-Emy162，and obtain highly purified CTB-Emy162.

EchinococcusmultilocularisEmy162 Prokaryotic expression system

R383.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.002

2015-06-09

#：青海省科技廳項目(編號：2014-ZJ-716)；青海大學中青年團隊項目(編號：2014-QYT-1).*：第一通訊作者，副教授，碩士研究生導師，yangdancairang@163.com；**：第二通訊作者，教授，碩士研究生導師，dengyong@medmail.com.cn. 周虎(1989～)，男，漢族，安徽籍，在讀碩士，青海大學普通外科學專業