新型診斷標志物循環miRNA的研究進展與應用

何順偉綜述，魏曉星，2＊審校

(1.青海大學生態環境工程學院；2.青海大學醫學院基礎醫學部，青海 西寧 810016 )

新型診斷標志物循環miRNA的研究進展與應用

何順偉1綜述，魏曉星1，2＊審校

(1.青海大學生態環境工程學院；2.青海大學醫學院基礎醫學部，青海 西寧 810016 )

循環miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩定存在的miRNA分子，具有差異表達明顯、檢測靈敏、取材方便等特點。循環miRNA可作為一種新型診斷標志物分子，在癌癥預測、產前診斷、損傷及感染檢測等多個方面有臨床應用前景。本文即對循環miRNA的來源和功能、診斷標志物潛能及臨床應用前景等方面的研究進展作一綜述，并對目前應用中 存在的相關問題進行探討。

1 循環miRNA概述

MiRNA是一類長度約為18-24 nt左右的內源性單鏈非編碼小分子RNA，它與mRNA的3′ UTR互補結合致mRNA直接降解或抑制其翻譯而干擾蛋白質的合成，主要在轉錄后水平調節基因的表達。自1993年被發現以來[1]，miRNA獨特的分子結構和功能成為世界關注的焦點，開辟了分子生物學研究的一個新領域。

miRNA在進化上具有極高的保守性、時序性、組織特異性及穩定性等特點。研究表明在血清、血漿等體液中能夠檢測到穩定存在的miRNA，即循環miRNA[2，3]。循環miRNA在不同生理病理條件下表達水平差異明顯，與個體的健康水平密切相關[4～6]。隨著分子生物學技術的發展，循環miRNA的檢測手段日漸趨于成熟，靈敏度高且操作損傷小，有廣闊臨床應用前景。

2 循環miRNA的來源和功能

2.1 細胞內miRNA的產生和作用機制

細胞內miRNA的產生過程同蛋白編碼基因的轉錄過程十分相似。首先，miRNA基因在RNA聚合酶II或III作用下轉錄形成初級miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA長度從200 nt到數千nt不等，經修飾加工后形成含有5′ cap和3′ poly A尾的特征性發卡結構。然后，pri-miRNA被Drosha-DGCR8復合體切割成約70 nt的發卡狀miRNA前體(pre-miRNA)，繼而經exportin-5等蛋白轉運到細胞質中。最后，pre-miRNA被Dicer酶剪切成約22 nt的miRNA： miRNA*雙鏈，其中一條成熟的單鏈miRNA與Argonaute蛋白等結合被引導進入RNA誘導沉默復合體(RISC)中，另一條單鏈miRNA*被降解(圖1)。

成熟的單鏈miRNA經堿基互補靶向結合到mRNA的3′ UTR，通過直接降解mRNA或抑制其翻譯來調控基因的表達。資料顯示[7]，miRNA與其靶基因mRNA的堿基互補程度將決定mRNA是降解還是抑制：當二者完全互補時直接降解mRNA，多發于植物中；當二者不完全互補時將抑制靶基因蛋白翻譯，多發于動物中。作為一種表達調控因子，miRNA能夠靶向調控大約60%的蛋白編碼基因[8]，且在細胞增殖、分化、凋亡、免疫、炎癥等多種生理病理調控過程中起核心作用[9]。miRNA異常表達、加工或突變同樣會使與之相關的靶基因活性改變而影響正常的基因功能，進而造成癌癥、心臟病、糖尿病等多種疾病發生[10]。miRNA的產生和作用機制如圖1所示。

2.2 循環miRNA的來源和功能

關于循環miRNA的來源存在較大爭議，目前主要有兩種觀點。第一，miRNA從受損或凋亡的細胞中被動滲出進入體液循環，如miRNA-208在心臟中特異性表達，當發生心肌梗死時可在血漿中檢測到[11]。第二，miRNA通過兩種方式主動分泌進入體液循環(圖1)，一種是與高密度脂蛋白(HDL)、核酸蛋白1(NPM1)以及家族蛋白2(Ago2)等特異結合分泌至細胞外；另一種則是miRNA被包裝在微體(microvesicle)或外來體(exosomes)等活性囊泡中分泌至細胞外。有學者發現[12]，miRNA的分泌需要神經酰胺的參與，而神經酰胺的合成受到神經磷脂酶2(nSMase2)控制。

Pol II：RNA聚合酶；Drosha/DGCR8：RNase III酶；Exportin-5：蛋白轉運體；Dicer：剪切酶；Pri-miRNA：初級miRNA；Pre-miRNA：前體miRNA；RISC：RNA誘導沉默復合體；exosomes：活性囊泡；Ceramide：神經酰胺

圖1 miRNA的產生和作用機制示意圖

Figure 1 Biogenesis and mechanism of miRNA

對循環miRNA的功能研究尚處于起步階段，其中最引人注目的就是循環miRNA參與細胞間的信息交流。即miRNA可從某一細胞產生、釋放至體液后被另一細胞識別、攝取和利用，最終實現細胞間信息交流。Zhang等發現[13]，微血管內皮瘤細胞-1能夠攝取體內血細胞或體外培養的人單核細胞分泌的循環miRNA-150調節原癌基因c-Myb的表達。Pegtel等[14]通過體外共培養實驗證實B細胞感染EB病毒后分泌的miRNA，可被外周血單核細胞攝取并抑制相應的EB靶基因表達。此外，循環miRNA還被發現具備一些特殊功能，如調控腫瘤發生和免疫反應，參與造血和細胞分化等。

3 循環miRNA的診斷標志物潛能

由于傳統蛋白類生物標志物成分復雜，存在翻譯后修飾及低靈敏度、低豐度和低特異性等不足，限制了其臨床應用。近年人們發現循環miRNA具備穩定性好、表達差異明顯、檢測靈敏以及能及時反映人體狀況等特征，是一類潛在的新型診斷標志物分子。

3.1 循環miRNA的穩定性

鑒于體液中含有豐富的RNase，所以學界普遍認為體液中的miRNA是極不穩定的。而有研究發現，循環miRNA在RNase作用、多次凍融、煮沸、極端pH和溫度等狀況下并未發生顯著性變化[3]。進一步實驗顯示，循環miRNA大多不是以游離形式存在的，而是與特殊蛋白結合[15]或包裹在活性囊泡中[16]以復合體的形式存在于體液中，因而具備了抗RNase降解的能力，能夠穩定保存。這一特性為循環miRNA發揮生物學功能提供了前提保證，也為其作為生物標志物提供了可能。

3.2 循環miRNA的表達差異

循環miRNA已被多次證實在不同生理病理條件下具有明顯的表達差異，與個體的生理病理狀態密切相關。例如，Gilad等[17]對比懷孕婦女與未孕婦女血清的miRNA發現，血清miR-526a和miR-527在孕期顯著表達并隨著妊娠周數增加而升高。并且Chim等[18]實驗顯示，血漿miRNA-141和miRNA-149在孕婦產后表達水平顯著性下降。此外，不同健康個體的循環miRNA表達水平沒有顯著差異，而疾病能夠明顯影響循環miRNA的表達，并且隨病情進展其表達譜呈現動態變化。如循環miR-122在肝臟病變中顯著表達[4]，循環miR-125在肺部病變中顯著表達[5]，循環miR-483在胰腺病變中顯著表達[6]。這些差異表達的循環miRNA既是其功能研究的基礎，又是潛在的診斷標志物分子。

3.3 循環miRNA的檢測方法

由于循環miRNA片段小、表達量低，使其定量檢測受到限制。盡管如此，近年來仍發展了多種有效的循環miRNA檢測方法[19，20]，不僅包括傳統的cDNA文庫克隆法和Northern blot、qRT-PCR法，還包括新近發展起來的基因芯片技術、高通量測序技術。其中cDNA文庫克隆法是發現新miRNA分子的首選方法，大部分已知的miRNA都是通過cDNA文庫克隆發現和鑒定的。Northern blot法是驗證和確認循環miRNA的重要方法。qRT-PCR法是循環miRNA定量檢測最常用的有效方法，可以精確地定量分析樣本中微量miRNA的表達。基因芯片技術可以實現快速、高通量的miRNA表達分析。高通量測序技術是目前最具前景的檢測循環miRNA的技術，可以用于檢測miRNA組織特異性和時序特異性表達。我們可以根據自己的研究目的選擇適合的檢測方法。隨著分子生物學技術的發展，循環miRNA的檢測手段又有了新的改進和發展，如鎖核酸(LNA)探針法、Stem loop RT-PCR法、納米金標記法和滾環擴增法等[21]使循環miRNA的檢測具有更高的靈敏度和精確度，為其成為診斷標志物提供技術支持。

4 循環miRNA的應用前景

4.1 循環miRNA作為癌癥標志物

循環miRNA的表達水平與癌癥的發生和演進密切相關，具備類似致癌基因或抑癌基因的作用，并且不同癌癥類型具有特定的表達譜。最早由Lawri等[22]報道，彌漫性大B細胞淋巴瘤患者血清中miRNA-155、miRNA-210和miRNA-21表達水平較正常對照明顯升高，可作為彌漫性大B細胞淋巴瘤的診斷標志物。之后關于循環miRNA作為結直腸癌、肝癌、肺癌、白血病等癌癥標志物的研究屢見報道。對循環miRNA作為癌癥標志物的相關研究進行如下總結(表1)。

表1 循環miRNA作為癌癥標志物

Table 1 Circulating miRNA as diagnostic markers for different human cancer

注：“↑”：miRNA表達上調；“↓”：miRNA表達下調.

4.2 循環miRNA作為產前診斷標志物

目前，產前診斷通常依靠侵入性檢測手段，風險較高，母體血漿中miRNA的發現為非侵入性的產前診斷開創了可能，并且穩定性好、特異度高。近年來，Zahm等[29]證實，循環miR-200b/429水平可作為嬰兒膽道閉鎖的診斷指標。Zhu等[30]通過Solid測序和qRT-PCR等證實，miRNA-196、miRNA-22、miRNA-29c和miR-375在行孕期先天性心臟病檢測的孕婦的血清中表達上調，可作為產前先天性心臟病的診斷指標。Lalevee等[31]證實，在先兆子癇孕婦胎盤中miR-455-3p和miR455-5p表達顯著性下調，在孕婦血液中檢測到miR-455，表明循環miR-455可作為孕婦先兆子癇的診斷指標。

4.3 循環miRNA作為損傷標志物

循環miRNA-122已證實在藥物、病毒、酒精和化學誘導的肝損傷中表達上調。Huang[4]等在膽道梗阻誘導的膽汁淤積肝損傷的小鼠中發現血清miRNA-122表達顯著升高。因此，循環miRNA-122具有肝損傷診斷價值。另外，在急性腎缺血損傷的小鼠血漿中miR-714、miR-1188、miR-1897-3p、miR-877*和miR-1224的表達水平顯著高于對照組，且miR-1897-3p和Nucks1基因表達緊密相關[32]。急性脊髓損傷的小鼠血漿中miR-219、miR-384-5p和miR-9*在損傷12 h后表達水平顯著升高，并同損傷程度相關[33]。這些結果表明，循環miRNA具備作為組織損傷診斷標志物的潛能。

4.4 循環miRNA作為感染標志物

循環miRNA在感染性疾病宿主和病原體的相互作用過程中發揮重要作用，在病原體感染進程中循環miRNA表達譜呈現特征性改變，可以作為篩選和診斷感染性疾病的標志物。如HBV病人肝纖維化病變過程中有12種血漿miRNA差異表達明顯，其中10個上調，2個下調[34]。HCV患者血漿miRNA中miR-122、miR-134、miR-424-3p和miR-629-5p表達明顯上調[35]。Morán等[36]研究甲型H1N1流感病毒A(A/H1N1)輕、重型患者及同居者和健康者的循環miRNA表達譜時發現，miR-150、miR-29c、miR-145、miR-22和miR-150在重型患者中呈差異性表達，其中miR-150較輕型患者顯著性過表達，而miR-210、miR-126和miR-222在同居者中表達水平下降。

5 存在問題及展望

開發循環miRNA作為診斷標記物具有重要的理論和實踐意義，但目前仍然存在以下幾個問題需要我們去解決。1、體液miRNA濃度低分離提取繁瑣，費用高，加上可能存在mRNA降解或其他小RNA的干擾，使獲取的miRNA的質量難以保證。2、缺乏統一準確的循環miRNA檢測方法，目前不同檢測miRNA的手段都存在各自的局限，如對于部分豐度較低且具有組織和時序特異性的miRNA分子而言，很難構建其cDNA文庫；Northern blot方法繁瑣并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測；qRT-PCR實驗結果很大程度上依賴于引物和探針的設計；基因芯片技術準確性和可重復性較差，要求初始樣本量大；高通量測序技術價格昂貴且操作費時。3、目前對循環miRNA作為診斷標志物的研究尚處于探索階段，研究的病種還不全面，所檢測的病例數也有限，篩選出的可能作為診斷標志物的循環 miRNA的靈敏性和特異性尚需要進一步實驗驗證。4、最重要的是循環miRNA的產生和作用機制仍不清楚，不同生理病理條件下循環miRNA參考值范圍尚未確定。

對循環miRNA的研究已經成為當今醫學領域的熱點，可以預期這種趨勢將繼續延續。循環miRNA作為診斷標志物，將改變和補充對疾病發生發展的傳統認識，同時整合基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學和系統生物學等相關研究的知識，從全方位闡明多種疾病產生和發展的分子機制，使疾病檢測手段更加豐富和有效。相信隨著循環miRNA生成機理、生物學功能以及檢測手段逐步被闡明和標準化，其在未來的無創診斷中將展示出廣闊的應用前景。

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*：國家自然科學基金項目(31260015) 何順偉(1988～)，女，漢族，河南信陽，在讀碩士研究生

R446.11

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.012

2015-11-11

*通訊作者：魏曉星，副教授，研究生導師，Email： weixiaoxing@tsinghua.org.cn