便攜掃描式熒光儀的研發

趙忠龍，楊志偉，王　海，張　晶，閔小平，*，葛勝祥

( 1．廈門大學信息科學與技術學院，福建廈門361005; 2．廈門大學國家傳染病疫苗與診斷試劑研究工程中心，福建廈門361102)

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便攜掃描式熒光儀的研發

趙忠龍1，楊志偉1，王海1，張晶2，閔小平1，2*，葛勝祥2

( 1．廈門大學信息科學與技術學院，福建廈門361005; 2．廈門大學國家傳染病疫苗與診斷試劑研究工程中心，福建廈門361102)

摘要:為了能夠實現對血液中特定抗原濃度的即時檢測( POCT)，研制了基于時間分辨熒光免疫分析技術的便攜式熒光儀．熒光儀以波長為365 nm的紫外LED作為激發光源，經光學結構產生線光斑進行掃描以及激發熒光信號，最后對光電二極管收集的光信號數據進行平滑、求斜率處理．使用該儀器對我們研發的紙條進行檢測，并分析其靈敏度，結果表明稀釋倍數和檢測線面積/控制線面積( AT/AC)之間乘冪關系較好，相關系數為0．994 3．儀器靈敏度、穩定性好，同時成本很低．

關鍵詞:即時檢測;時間分辨熒光免疫分析;掃描式熒光儀

目前，體外診斷行業的一個突出特點是它的兩極化發展趨勢，一極是大型自動化醫學檢驗儀器，另一極是小型即時檢測( point－of－care－testing，POCT)儀器．其中，POCT儀器檢測過程方便、快速且高效，獲得了市場越來越高的認可度，在臨床應用中的影響不斷擴大［1－3］．

POCT型側向流紙條檢測技術結合定量免疫檢測技術在醫療保健、疾病診斷與防治等方面一直發揮著巨大的作用［4－5］．類似的定量免疫檢測方法已有相關的報道．例如Li等［6］為量化上轉換發光( UCP)粒子并做出其圖像，研制出了二維光學掃描系統，并將此系統應用于上轉換發光顆粒標記免疫檢測．在功率為1．2 W，發光波長為980 nm的光纖耦合激光二極管上覆蓋一個透明的微流控芯片就可以激發UCP粒子發光，這種激發光可用光電倍增器( PMT)檢測．使用此掃描儀，從X和Y兩個方向掃描二維紙條只需要8 min［7］．

本文介紹了一種以時間分辨熒光免疫分析為生物依據的掃描式熒光儀［8－10］．它采用光纖作收發光的通道，光學掃描采用線掃描的方式，避免了點掃描的局部性和不穩定性．采用16位的AD轉換器將高靈敏度光電二極管捕捉到的光信號轉換成數字信號，并對收集到的數字信號進行分析，建立相關的數學模型，為后面的定量分析做基礎．儀器相對其他設備而言，在保證檢測靈敏度的同時，成本低、穩定性好．

1實現方法及原理

1. 1時間分辨熒光免疫分析

熒光免疫分析是熒光檢測技術和免疫學反應相互結合起來的一種免疫分析方法．其基本實現方法如下:使用某種特異性抗體，在其上標記熒光基團使之成為特異性試劑，與對應抗原結合形成復合物［11－12］．

使用時間分辨熒光免疫技術進行檢測時，激發光激發標記物后適當延遲一段時間再對標記物熒光進行檢測，可以提升檢測靈敏性，降低本底熒光干擾，增強穩定性和特異性．而且還具有線性范圍更寬，試劑壽命更長的優點［13－14］．

1. 2熒光儀紙條檢測原理

熒光儀紙條檢測原理如圖1所示:在檢測紙條上面貼有一層硝酸纖維素膜，用于固定抗原抗體結構．

紙條前端是質控線( control)，質控線由包被羊抗鼠抗體和單克隆抗體(含熒光微球)組成，包被羊抗鼠抗體可以自動識別單克隆抗體，并形成穩定結構．所以質控線的熒光強度基本固定，用于判斷紙條是否合格．

紙條后端是檢測線( test)，它由包被單克隆抗體和單克隆抗體組成，這兩者不會結合，但是分別都可以和抗原結合，從而形成一個包被單克隆抗體+抗原+單克隆抗體的夾心結構，抗原越多，與之穩定結合固定在硝酸纖維素膜上的熒光微球越多，從而可以判斷熒光強度．

圖1熒光紙條檢測原理Fig．1 Strip detection principle of fluorometer

掃描式熒光儀使用的紙條結構如圖2所示．

圖2紙條結構平面圖Fig．2 Structure of the test strip

2光學設計

光學模塊是掃描式熒光儀的核心模塊，它控制著儀器信號源，對光信號進行傳播和接收，決定著儀器最終檢測結果［15］．所以在光學模塊設計過程中，需要提高激發光光源工作穩定性，降低激發光傳輸衰減度．為此，選擇高靈敏度光電二極管( ODA－6WB－500M)和石英光纖，具體如圖3所示．

從圖3可知，發射光源1負責紫外光的產生，濾光片3用于過濾發射光源，光探測單元2負責接收熒光紙條7反射的熒光信號，濾光片4負責對所接收到的光信號進行濾波處理．其中光纖(呈Y型)負責對光形狀轉換傳遞等，具體如圖4所示．

從圖4可知，左端通光2連接LED燈接口，用于傳播LED燈發射的紫外光．在最右端將柱形光轉成切面為條形的光(長度等于紙條上檢測線寬度)，由右端通光2照射到紙條上．

圖3光學模塊設計圖Fig．3 Design of the optical module

圖4光纖刨面圖Fig．4 Cross－section of the optical fiber

在紫外光的照射下，紙條上的熒光顆粒就會被激發出熒光，右端通光1將此熒光傳遞給左端通光1供光電二極管接收．

光電二極管將接收到的熒光經過處理，傳遞給模數轉換芯片進行下一步的處理．

3數據處理

3. 1讀值檢測原理

對紙條進行一次掃描，可以檢測到兩個熒光波峰，記錄下兩個波形面積之比，然后利用濃度已知的標準紙條進行大批量生物實驗，建立如下數學關系:“檢測線面積/控制線面積( AT/AC)～檢測物試劑濃度”．最后利用建立起來的數學模型去判斷未知的檢測試劑濃度．

3．2算法過程

在數學中，針對連續的數學模型，我們使用求導并對導函數分析來獲得某曲線的波峰信息．

根據此思想，一次檢測完成，獲得模數轉換以后的1 200個熒光數據點( Data［1 200］)如圖5，做如下處理:

圖5原始數據示意圖Fig．5 Origin data

3. 2. 1平滑處理

對于得到的原始數據，會有鋸齒數據存在，對此我們要先進行平滑處理:

3. 2. 2求斜率

過濾掉鋸齒數據之后，就可以求Smooth［1 200］的斜率．由于操作點是離散點，所以我們借用求導的原理(圖6) :

圖6求導原理Fig．6 Principle of derivation

其中: ( x1，y1)，( x2，y2)為相鄰的點，這里使用了一個長度為2的窗口進行滑動．當前點的斜率可表示為:

其中，i的取值范圍5～1 195．Slope［1 200］如圖7所示．

圖7斜率示意圖Fig．7 Slope data

3．2．3求面積

在求面積之前，首先要找到波峰的起始點．

在求起始點時，為了精確，對Slope數據進行大量實驗確定滑動窗口為10，即從Data［i］到Data［i+9］共10個點的平均值作為當前點的斜率．

起點:

要得到終點，就需要先找出開始下降的點．下降點:

終點:

其中，j的范圍為: 10～1 190．

最后一步求面積，假設:基線值、波峰寬度、毛面積、凈面積依次如下:

通過以上分析，即可得到圖5中波峰的信息，具體如表1所示．

4性能分析

表1波峰檢測結果Tab．1 Result of peak recognition

為了測試熒光儀的靈敏度，用其來檢測血液中丙型肝炎病毒抗原( HCV)的濃度．

控制線( C線)為羊抗鼠多抗，檢測線( T線)為12F12抗體(起包被作用)，樣品墊中為W4G3抗體(含熒光顆粒，起標記作用)．

在吸收墊的作用下，血液中的HCV抗原、12F12抗體、W4G3抗體在T線處結合均形成穩定結構，W4G3和羊抗鼠多抗在C線處結合成穩定結構．

使用標準紙條進行測試，對已知固定濃度樣本按不同比例進行稀釋，檢測得到AT/AC的值如表2所示．

表2 AT/AC與稀釋倍數Tab．2 AT/AC and dilution ratio

由AT/AC與稀釋倍數得到乘冪趨勢線如圖8所示．

由圖8可知，AT/AC和稀釋倍數之間乘冪趨勢線，相關系數R2= 0．994 3，說明在稀釋倍數足夠大的時候，儀器檢測出的值逐漸趨于一致，這與我們預計的一致，也進一步說明該儀器靈敏度高．

5結論

本文主要介紹以時間分辨熒光免疫分析技術為生物檢測原理實現掃描式熒光儀的研發．掃描式熒光儀工作時，紫外LED燈發出的光經過光學結構后，以條形光束照射在熒光顆粒標記的紙條上，模數轉換器將高靈敏度光電二極管檢測到的熒光信號轉換成數字信號，交由處理器，至此完成一個條形區域(長4 mm，寬0．8 mm)熒光強度的采集．并設計算法對檢測到的離散數據進行處理，構建并根據“AT/AC～檢測物濃度”數學關系計算出待檢測物質的濃度．通過大量生物實驗表明，掃描式熒光儀具有檢測速度快、可重復性高、數據線性關系好等優點．此外，根據抗原、抗體結合的特異性，設計出對應的熒光紙條，就能很好地對血液中不同物質進行快速檢測，而且儀器采用紫外LED作為激發光源以及光電二極管進行光電轉換，大大降低了儀器的成本．

圖8 AT/AC與稀釋倍數線性關系Fig．8 Dilution ratio AT/AC linear relationship

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Developing a Scanning-fluorescence Reader

ZHAO Zhonglong1，YANG Zhiwei1，WANG Hai1，ZHANG Jing2，MIN Xiaoping1，2*，GE Shengxiang2

( 1．School of Information Science and Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2．National Institute of Diagnostics and Vaccine Development In infection Diseases，Xiamen 361102，China)

Abstract:We developed portable scanning－fluorescence readers based on the time－resolved fluoroimmunoassay in order to quickly measure the concentration of antigen in blood point－of－care testing ( POCT)．An ultraviolet LED with laser operating at 365 nm is used in our experiment as the thermal source．The special optical structure can form a strip shot，which generated signal from fluorescence excitation．The device subsequently addresses waveform data using a gradient smoothing method．We measured the strips that are made by our laboratory，and show that the dilution ratio and AT/AC reach a correlation index of 0．994 3．The instruments enjoys advantages of high sensitivity，high stability，and low cost．

Key words:point－of－care－testing ( POCT) ; time－resolved fluoroimmunoassay; scanning－fluorescence reader

*通信作者:mxp@ xmu．edu．cn

收稿日期:2015－03－06錄用日期: 2015－05－13

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．023

中圖分類號:TH 776

文獻標志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0121－05

引文格式:趙忠龍，楊志偉，王海，等．便攜掃描式熒光儀的研發［J］．廈門大學學報(自然科學版)，2016，55( 1) : 121－125．

Citation: ZHAO Z L，YANG Z W，WANG H，et al．Developing a scanning－fluorescence reader［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 121－125．( in Chinese)