真菌多糖激發(fā)子對辛格粒毛盤菌抗氧化多酚積累的影響

紀　靜,　楊　柳,　李貝貝,　徐　燦,　葉　明

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥　230009)

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真菌多糖激發(fā)子對辛格粒毛盤菌抗氧化多酚積累的影響

紀靜,楊柳,李貝貝,徐燦,葉明

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥230009)

摘要:文章研究了辛格粒毛盤菌胞外多酚的抗氧化活性,并以啤酒酵母多糖作為真菌激發(fā)子,研究其對辛格粒毛盤菌胞外多酚積累的影響。研究結(jié)果表明,多酚的抗氧化活性隨啤酒酵母多糖質(zhì)量濃度的增大而增強,當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 g/L時,多酚的還原能力較強,且對O2-·和DPPH·的清除作用分別達到54.50%、70.48%;在粒毛盤菌發(fā)酵液中添加啤酒酵母多糖激發(fā)子,可以增強菌絲體中苯丙氨酸解氨酶和一氧化氮合酶的活性,同時提高胞外多酚的產(chǎn)量,其中添加80 mg/L激發(fā)子組的胞外多酚產(chǎn)量最大,為83.30 mg/L,比空白對照組提高了28.0%。因此啤酒酵母多糖激發(fā)子可提高辛格粒毛盤菌抗氧化多酚的積累。

關(guān)鍵詞:粒毛盤菌;胞外多酚;抗氧化活性;真菌多糖激發(fā)子

0引言

多酚是一類含有1個或多個酚羥基的小分子次生代謝產(chǎn)物,一般存在于植物和微生物中[1]。微生物多酚具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤細胞增殖等多種生物學(xué)活性[2-4],可以作為一種重要的天然資源應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。

1972年,Keen將激發(fā)子(elicitor)定義為能刺激植物細胞產(chǎn)生和積累生物活性成分的物質(zhì)[5]。隨著對激發(fā)子研究的深入,激發(fā)子定義的范圍也在擴大,指任何能誘導(dǎo)產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的分子[6]。激發(fā)子來源于植物、真菌及細菌等生物,其中真菌激發(fā)子主要是真菌的細胞表面結(jié)構(gòu)或分泌物,化學(xué)成分包括幾丁質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)及糖蛋白等,真菌多糖是研究較多的真菌激發(fā)子[6-9]。有研究發(fā)現(xiàn),疫霉和曲霉多糖激發(fā)子可以提高蛹蟲草的生物量和蟲草菌素的產(chǎn)量[7]。以鏈孢霉多糖作為激發(fā)子能夠提高苯丙氨酸解氨酶的活性和NO的含量,促進樺褐孔菌多酚的積累[9]。

粒毛盤菌(Lachnum)是一類腐生性真菌,在發(fā)酵培養(yǎng)條件下能夠產(chǎn)生黑色素、多糖等物質(zhì)[10-11]。近期研究發(fā)現(xiàn),粒毛盤菌的一些菌株可以產(chǎn)生多酚類物質(zhì),且發(fā)現(xiàn)多酚具有抗氧化性和抑菌活性[1,12]。粒毛盤菌多酚作為一種天然活性物質(zhì),具有十分廣闊的應(yīng)用前景,研究粒毛盤菌多酚對充分利用粒毛盤菌資源具有十分重要的意義,但是由于多酚的產(chǎn)量較低,制約了對其的研究開發(fā)。本文研究了辛格粒毛盤菌胞外多酚的抗氧化活性,并以啤酒酵母多糖作為激發(fā)子,研究其對多酚積累的影響。

1材料與方法

1.1供試菌株

辛格粒毛盤菌YM296(Lachnumsingerianum)和啤酒酵母(S.cereviseae),均保藏于合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室。

1.2試劑

Folin-Ciocalteu試劑,Sigma公司;沒食子酸,Sigma公司;一氧化氮合酶試劑盒,南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH,上海源聚生物科技有限公司;其余試劑均為分析純。

1.3培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,瓊脂15.0 g/L,pH自然。

液體培養(yǎng)基:蔗糖20.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,氯化鎂0.8 g/L,酪氨酸0.01 g/L, pH自然。

1.4粒毛盤菌胞外多酚的提取

將辛格粒毛盤菌種子液接種于500 mL錐形瓶中,在160 r/min、26 °C下發(fā)酵8 d。參考文獻[1]的方法提取粒毛盤菌胞外多酚。將粒毛盤菌發(fā)酵液濃縮后,添加3倍體積的70%乙醇,4 ℃放置24 h,離心后取上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,再利用等體積乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機相,冷凍干燥得粒毛盤菌胞外多酚。

1.5辛格粒毛盤菌胞外多酚抗氧化活性的測定

1.5.1胞外多酚還原力的測定

參考文獻[13]的方法略做修改測定胞外多酚的還原力。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)的待測液,加入2.5 mL 200 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH=6.6)和2.5 mL 1%的KCN溶液,混合均勻后,在50 ℃下水浴30 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng),在1 000 r/min離心8 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,充分混合后在700 nm處測定吸光值。 [12]的方法測定胞外多酚對O2-·的清除能力。取4.5 mL 50 mmol/L(pH=8.2)的Tirs-HCl緩沖液,在25 ℃預(yù)熱20 min后,加入1 mL不同質(zhì)量濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)的待測液和0.3 mL 7 mmol/L的鄰苯三酚溶液,充分混合后于25 ℃水浴4 min,加入1 mL 10 mmol/L HCl終止反應(yīng),在325 nm處測吸光值A(chǔ)span。胞外多酚對O2-·的清除率的計算公式為: [14]的方法測定胞外多酚對DPPH·的清除能力。分別將0.3 mL不同質(zhì)量濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)的待測液與2.7 mL的DPPH·乙醇溶液充分混合后,置于暗處60 min至吸光值穩(wěn)定,在517 nm處測定吸光值,空白對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品,多酚對DPPH·的清除率的計算公式為: [15]的方法提取啤酒酵母胞外多糖。將酵母菌發(fā)酵液于4 000 r/min離心15 min,取上清液,濃縮后加入3倍體積的95%乙醇,4 ℃放置24 h,于4 000 r/min下離心10 min后取沉淀,冷凍干燥后得粗多糖,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2胞外多酚對O2-·清除能力的測定

O2-·清除率=[1-(AX-AX0)/A0]×100%。

其中,AX0為以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液的吸光值;A0為以蒸餾水代替胞外多酚溶液的吸光值。

1.5.3胞外多酚對DPPH·清除能力的測定

DPPH·清除率=[(A0-AX)/A0]×100%。

其中,A0為空白對照組的吸光值;AX為不同質(zhì)量濃度樣品的吸光值。

1.6真菌多糖激發(fā)子對胞外多酚積累的影響

1.6.1真菌多糖激發(fā)子的制備

1.6.2供試菌株的培養(yǎng)

用打孔器將直徑大小相同的菌塊接種于盛有190 mL液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,26 ℃、160 r/min培養(yǎng)12 d,培養(yǎng)至第2天時加入真菌多糖激發(fā)子,使培養(yǎng)液中真菌激發(fā)子的最終質(zhì)量濃度分別為0、40、80、120 mg/L,每組重復(fù)3次,每2 d取樣測定相關(guān)指標。

1.6.3生物量的測定

將辛格粒毛盤菌發(fā)酵液抽濾獲得菌絲體,用蒸餾水清洗2～3次后于60 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量,計算菌絲體干質(zhì)量的質(zhì)量濃度，具體公式為：

1.6.4胞外多酚產(chǎn)量的測定

按照上述1.4的方法提取粒毛盤菌胞外多酚。參照文獻[16]的方法,采用Folin-Ciocalteu法測定胞外多酚產(chǎn)量,并制作沒食子酸標準曲線。取1 mL待測溶液于10 mL試管中,然后依次加入1 mL去離子水和0. 5 mL Folin-Ciocalteu試劑,混勻后避光放置8 min,再加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液,蒸餾水定容至10 mL,混勻后室溫避光放置2 h,在765 nm處測定吸光度。所有實驗均重復(fù)3次。

1.6.5活性的測定

參照文獻[1]的方法測定粒毛盤菌菌絲體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)的活性。菌絲體內(nèi)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的活性采用ELISA試劑盒測定。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果分析

2.1辛格粒毛盤菌胞外多酚的抗氧化活性

2.1.1胞外多酚的還原力

多酚是一類含有多個酚羥基的化合物,可通過氫原子的轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移、金屬螯合等機制發(fā)揮抗氧化作用[17]。抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在一定的關(guān)系,還原力越強,抗氧化性越強[18]。多酚的還原力如圖1所示。由圖1可知,辛格粒毛盤菌胞外多酚具有明顯的還原能力,其還原力隨著自身質(zhì)量濃度的增加而增強,但在相同質(zhì)量濃度下,胞外多酚的還原力低于葡萄多酚。

圖1　多酚的還原力

2.1.2胞外多酚對O2-·的清除作用

超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)的一種氧自由基,過多的自由基會對機體的細胞膜、DNA、蛋白質(zhì)等造成氧化損傷[19]。多酚對O2-·具有明顯的清除作用,清除作用隨著多酚質(zhì)量濃度的增加而增強,呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,如圖2所示,但相同質(zhì)量濃度下胞外多酚清除作用略低于葡萄多酚,當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 g/L時,辛格粒毛盤菌胞外多酚與葡萄多酚的清除率分別為54.50%和74.91%。

圖2　多酚對O2-·的清除作用

2.1.3胞外多酚對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,清除DPPH·的能力主要與酚環(huán)結(jié)構(gòu)上的羥基有關(guān),羥基數(shù)越多,清除自由基的能力也就越強[12]。多酚對DPPH·的清除作用如圖3所示。

由圖3可看出,多酚對DPPH·的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強,呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。相同質(zhì)量濃度時,辛格粒毛盤菌胞外多酚對DPPH·的清除作用略低于葡萄多酚。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 g/L時,辛格粒毛盤菌胞外多酚與葡萄多酚對DPPH·的清除率分別為70.48%和83.60%。

圖3　多酚對DPPH·的清除作用

2.2真菌多糖激發(fā)子對胞外多酚積累的影響

2.2.1真菌多糖激發(fā)子對生物量積累的影響

真菌多糖激發(fā)子對生物量的影響如圖4所示。由圖4可知,辛格粒毛盤菌的生物量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。在培養(yǎng)第8天時,每組的生物量均達到最大,其中空白對照組的生物量最低，為5.19 g/L；80 mg/L真菌多糖激發(fā)子組的生物量最高，為6.17 g/L,與空白對照組相比存在顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果表明,真菌多糖激發(fā)子對辛格粒毛盤菌生物量的積累有一定的促進作用。

圖4　真菌多糖激發(fā)子對生物量的影響

2.2.2真菌多糖激發(fā)子對胞外多酚產(chǎn)量的影響

真菌多糖激發(fā)子對胞外多酚產(chǎn)量的影響如圖5所示,由圖5可看出,真菌多糖激發(fā)子提高了辛格粒毛盤菌胞外多酚的產(chǎn)量。在培養(yǎng)第8天時,各組的胞外多酚產(chǎn)量均達到最大值,但激發(fā)子質(zhì)量濃度與胞外多酚產(chǎn)量不呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,80 mg/L真菌多糖激發(fā)子組為83.30 mg/L,明顯高于其他3組,且與空白對照組(65.10 mg/L)相比提高了28.0%,存在顯著性差異(P<0.05)。辛格粒毛盤菌胞外多酚產(chǎn)量的增加可能是由于啤酒酵母多糖對粒毛盤菌次級代謝產(chǎn)物的積累有一定的誘導(dǎo)作用[8-9]，但是隨著培養(yǎng)時間的延長,多酚的產(chǎn)量呈下降趨勢,這可能是由發(fā)酵后期培養(yǎng)液中產(chǎn)生的自由基引起的[8]。

圖5　真菌多糖激發(fā)子對胞外多酚產(chǎn)量的影響

2.2.3真菌多糖激發(fā)子對PAL活性的影響

有報道顯示,PAL是多酚類化合物合成過程中的關(guān)鍵酶,它的活性與多酚的合成代謝密切相關(guān)[20]。真菌多糖激發(fā)子對PAL活性的影響如圖6所示。

圖6　真菌多糖激發(fā)子對PAL活性的影響

由圖6可看出,加入真菌多糖激發(fā)子的各組中，PAL的活性均明顯高于空白對照組。培養(yǎng)至第8天時,各組PAL的活性均達到最大,空白對照組的酶活為57.6 U/mg,40、80、120 mg/L真菌多糖激發(fā)子組的酶活分別為65.6、76.4、70.5 U/mg,120 mg/L組的PAL活性低于80 mg/L組。PAL活性與多酚產(chǎn)量的變化趨勢一致,這與文獻[9]報道的結(jié)果相似,原因可能是真菌激發(fā)子誘導(dǎo)PAL活性升高,促進了多酚的合成代謝,使多酚的積累量增加。

2.2.4真菌多糖激發(fā)子對NOS活性的影響

真菌多糖激發(fā)子對NOS活性的影響如圖7所示,由圖7可看出,加入真菌多糖激發(fā)子后,菌絲體中NOS的活性逐漸增大。培養(yǎng)至第8天時,各組的酶活均達到最大,空白對照組的酶活為73.5 U/mg,40、80、120 mg/L真菌多糖激發(fā)子組的酶活分別為113.3、150.3、130.5 U/mg,均顯著高于空白對照組(P<0.05),培養(yǎng)至第8天后NOS活性緩慢下降,與文獻[9]報道的結(jié)果具有相同的趨勢。

圖7　真菌多糖激發(fā)子對NOS活性的影響

NOS酶活的增大,可以提高菌絲體內(nèi)NO含量,NO是真菌次級代謝產(chǎn)物合成的信號分子[8]。有研究表明,適量的NO可激活真菌多酚的生物合成途徑,促進多酚的積累,但當(dāng)NO質(zhì)量濃度過高時,對多酚合成的誘導(dǎo)作用減弱,甚至產(chǎn)生抑制作用[1,21-22]。辛格粒毛盤菌胞外多酚的增加可能是由于真菌多糖激發(fā)子誘導(dǎo)PAL、NOS酶活升高和NO含量增加,從而促進胞外多酚的合成。而120 mg/L真菌多糖激發(fā)子組的生物量和多酚產(chǎn)量低于80 mg/L組,原因可能是高質(zhì)量濃度的激發(fā)子使菌絲體內(nèi)產(chǎn)生了過量的NO,對胞外多酚合成的促進作用減弱。

3結(jié)束語

本文研究了辛格粒毛盤菌胞外多酚的抗氧化活性和真菌多糖激發(fā)子(啤酒酵母多糖)對辛格粒毛盤菌胞外多酚積累的影響。結(jié)果顯示,辛格粒毛盤菌胞外多酚具有明顯的還原能力,且對O2-·和DPPH·均有較好的清除作用,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,表明辛格粒毛盤菌胞外多酚可以作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。研究還發(fā)現(xiàn),在粒毛盤菌發(fā)酵液中加入啤酒酵母多糖激發(fā)子后,粒毛盤菌的生物量、多酚產(chǎn)量以及PAL和NOS的活性均有不同程度的升高,這可能是由于適量的真菌多糖激發(fā)子可提高多酚合成代謝途徑中相關(guān)酶的活性,從而促進辛格粒毛盤菌胞外多酚的合成。該結(jié)果為進一步研究真菌激發(fā)子促進多酚合成的機理提供了依據(jù)。

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(責(zé)任編輯閆杏麗)

Effect of fungal polysaccharide elicitor on the accumulation ofLachnumsingerianumantioxidant polyphenols

JI Jing,YANG Liu,LI Bei-bei,XU Can,YE Ming

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:Antioxidant activity of extracellular polyphenols of Lachnum singerianum and the effect of the accumulation of polyphenols by adding S.cerevisiae polysaccharide as fungal elicitor were evaluated. With the increasing concentration of S.cerevisiae polysaccharide, the antioxidant activity of polyphenols increased. At a concentration of 2.5 g/L, polyphenols had a significant reducing power, and the scavenging effects of O2-·and DPPH· were 54.50% and 70.48% respectively. S. cerevisiae polysaccharide elicitor added in Lachnum improved the activities of nitric oxide synthase and phenylalanine ammonialyase, and also the accumulation of extracellular polyphenols. The accumulation of polyphenols was 83.30 mg/L in the group which had concentration of 80 mg/L of fungal elicitor, and it was the maximum in all groups and 28.0% higher than that of control group. The results showed that extracellular polyphenols of Lachnum singerianum had strong antioxidant activity and fungal elicitor could promote the accumulation of the polyphenols.

Key words:Lachnum; polyphenol; antioxidant activity; fungal polysaccharide elicitor

中圖分類號:Q939.99

文獻標識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)02-0265-06

Doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.02.023

作者簡介：紀靜(1988-),女,安徽亳州人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31270060)

收稿日期：2014-12-10；修回日期：2015-01-15

葉明(1959-),男,安徽懷寧人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.