高氧肺損傷中肺泡形成基因P311的動態變化及意義*

曾寶梅, 王予川, 黃　棟**

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州省人民醫院， 貴州 貴陽　550002)

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高氧肺損傷中肺泡形成基因P311的動態變化及意義*

曾寶梅1, 王予川2, 黃棟2**

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽550004； 2.貴州省人民醫院， 貴州 貴陽550002)

[摘要]目的： 探討肺泡形成基因P311在高氧肺損傷中的作用。方法： 成年的昆明小鼠64只，隨機分為空氣組和高氧組，空氣組置于室內空氣中飼養，高氧組置于同一室內氧艙中持續吸入氧濃度>90%的醫用氧氣復制高氧肺損傷動物模型；分別于1 d、3 d、7 d和14 d后取2組小鼠肺組織，蘇木精-伊紅染色觀察肺組織病理變化并鑒定造模是否成功；免疫組織化學染色和實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)檢測P311蛋白的分布和基因表達；酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測P311蛋白含量。結果： 高氧組小鼠隨著吸入高濃度氧氣時間的延長，肺組織病理改變逐漸加重，成功復制高氧肺損傷的動物模型；免疫組織化學染色顯示P311在肺組織主要定位于肺泡壁及肺泡隔膜生長點處，在空氣組小鼠肺組織中呈弱陽性反應，而在高氧組小鼠肺組織中呈強陽性反應；高氧組小鼠P311基因表達及蛋白含量較空氣組小鼠增高，隨吸氧時間的延長，P311基因表達及蛋白含量逐漸增高,在第7天時達高峰(P<0.05)。結論： 高氧肺損傷后P311基因表達增加。

[關鍵詞]肺泡形成基因； 基因表達； 高氧癥； 肺損傷； 小鼠

氧療是肺源性及非肺源性疾病所致呼吸衰竭時不可缺少的治療手段，然而長時間吸入高濃度氧氣，機體氧自由基產生增多，可對肺組織造成損傷,甚至導致慢性肺疾病(chronic lung disease，CLD)[1-2]。高氧肺損傷是一個復雜的過程, 有諸多因素、系統共同參與和介導高氧肺損傷的病理過程, 高氧導致的肺損傷越來越受到臨床醫生的重視[3]。相關高氧誘導肺損傷發生機制及其干預策略的研究報道日漸增多，但收益甚少。通過查閱文獻發現，P311作為肺泡形成過程中的重要基因可調節成纖維細胞的增生及轉分化，減輕疤痕組織的增生，但其在高氧肺損傷修復中的作用知之甚少。本研究通過構建小鼠高氧肺損傷動物模型，在組織水平探索P311在高氧肺損傷中的變化。

1材料及方法

1.1實驗動物與分組

普通級昆明小鼠購自貴陽醫學院動物中心，將60日齡的小鼠隨機分為空氣組和高氧組，兩組又分為1 d、3 d、7 d和14 d組，每組8只小鼠。

1.2方法

1.2.1高氧肺損傷動物模型高氧組小鼠置于氧艙中喂養，用測氧儀監測氧艙內的氧濃度使其維持在90%以上，氧艙內溫度與室內溫度相當，濕度60%左右，CO2濃度低于0.5%。每天定時開艙添加飼料和水,并更換小鼠墊料。空氣組均置于同一室內空氣中飼養。

1.2.2肺組織病理學檢查各組小鼠分別于空氣和高氧環境中飼養1 d、3 d、7 d和14 d后取左肺組織固定在4%多聚甲醛中， 蘇木精-伊紅染色后，光鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。并參照文獻按照充血、水腫、出血、炎性浸潤、肺泡結構破壞和組織增生等指標的輕重程度以及病變范圍進行評分及分析。

1.2.3肺組織P311蛋白分布免疫組織化學方法檢測肺組織P311蛋白的分布，P311多克隆抗體購自武漢BOSTER公司，工作濃度1∶200； 二抗及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，實驗中以PBS液代替一抗做為陰性對照，免疫組織化學染色方法檢測肺組織中P311蛋白分布。

1.2.4肺組織P311mRNA表達采用Real-Time PCR方法。從肺組織中提取總RNA(按照動物組織RNA提取試劑盒的步驟操作)，然后檢測RNA的完整性、純度及濃度。將符合要求的RNA逆轉錄成cDNA(按照逆轉錄試劑盒的步驟)，然后進行擴增。

1.2.5肺組織P311蛋白表達ELISA方法檢測P311蛋白，肺組織勻漿后采用雙抗體夾心ELISA法檢測,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3統計學處理

2結果

2.1各組小鼠的一般狀況

空氣組小鼠反應比較靈敏，活動良好，毛發光澤，鼻尖紅潤；高氧組小鼠隨著吸氧時間的延長，逐漸表現為反應遲鈍，精神萎靡，活動度下降，食量明顯減少，體重增長緩慢，毛發發澀、無光澤，鼻尖發紺，呼吸急促；停止吸氧后，小鼠表現為呼吸稍困難，鼻尖明顯發紺，頭顫，站立不穩，反應差。

2.2肺組織病理變化

肉眼觀察：空氣組小鼠肺組織呈均勻淡紅色，包膜光滑；高氧組小鼠的肺組織表面蒼白，有散在甚至彌漫的出血點。光鏡下觀察：空氣組小鼠肺組織肺泡發育成熟，無充血、水腫、出血、炎性浸潤、肺泡結構破壞和組織增生等。高氧1 d組小鼠與空氣組小鼠比較無明顯異常；高氧3 d組小鼠與高氧1 d組小鼠比較，在肺血管、氣管周圍有炎性細胞浸潤；高氧7 d組小鼠與高氧3 d組小鼠比較除了有炎性細胞浸潤外，可見肺泡充血、水腫；高氧14 d組小鼠與高氧7 d組小鼠比較可見肺泡腔明顯增大,部分肺泡融合、肺泡數量減少,肺間質細胞增生。高氧組小鼠隨著吸氧時間延長,肺組織病變逐漸嚴重，表現為肺泡腔內炎癥細胞滲出增多、間質水腫，典型小直徑的肺泡數目顯著減少，肺泡結構簡單化和囊泡化。肺組織病理變化評分結果提示，高氧7 d、14 d組小鼠與同時段空氣組小鼠比較，肺損傷明顯，差異有統計學意義(P<0.05)；高氧組3 d、7 d、14 d組內兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1及表1。

2.3肺組織P311蛋白的分布

P311肺組織中主要定位于肺泡壁及肺泡隔膜生長點處，在空氣組小鼠肺組織中呈弱陽性反應,部分細胞質呈淺染色。與空氣組小鼠比較，高氧組小鼠隨著吸氧時間的延長肺組織中P311逐漸呈強陽性反應，表現為細胞質中的棕色顆粒；從吸入高濃度氧后第3天，至第14天P311均呈強陽性反應，見圖2。

注：A為空氣組，B為高氧1 d組，C為高氧3 d組，D為高氧7 d組，E為高氧14 d組圖1　空氣組與高氧組小鼠肺組織蘇木精-伊紅染色(×400) Fig.1　Hematoxylin-eosin staining of lung tissue in air group and hyperoxia group

注：A為空氣組，B為高氧1 d組，C為高氧3 d組，D為高氧7 d組，E為高氧14 d組圖2　空氣組與高氧組小鼠肺組織免疫組織化學染色(×400)Fig.2　Immunohistochemical staining for air group and hyperoxia group

2.4肺組織P311 mRNA的表達

空氣組各時段小鼠肺組織中P311 mRNA表達無顯著變化。高氧組小鼠隨著吸氧時間的延長，P311 mRNA在肺組織里的表達逐漸增高，至吸氧第7天時，P311表達達高峰，各時段高氧組小鼠肺組織P311 mRNA表達均高于同時段空氣組小鼠(P<0.05)，見表2。

2.5肺組織P311蛋白的含量

酶聯免疫吸附測定法檢測顯示，空氣組小鼠肺組織P311蛋白含量無明顯變化；高氧組小鼠肺組織隨著吸氧時間的延長，肺組織中P311蛋白含量逐漸增高，至吸氧第7天時，P311蛋白含量達高峰。各時段高氧組小鼠肺組織中P311蛋白含量均高于同時段空氣組小鼠(P<0.05)，見表2。

表1　兩組小鼠肺組織病理變化評分(分)

(1)與空氣組比較，P<0.05；(2)高氧組各時段內比較，P<0.05

表2　兩組小鼠肺組織P311 mRNA表達及

(1)與空氣組比較，P<0.05；(2)高氧組各時段內比較，P<0.05

3討論

盡管氧氣對于挽救生命是必須的，但長時間吸入高濃度的氧氣對于細胞、器官而言都具有危害性[4]。肺臟直接與外界相通，因此長時間暴露在高濃度氧氣環境下最易受損[5-6]。高氧肺損傷早期病理改變為彌漫性肺泡炎癥，晚期肺泡間質增生，肺纖維化。肺纖維化影響患者今后肺功能，如何減輕高氧肺損傷患者肺纖維化，改善肺功能，促進肺損傷的無纖維化修復一直是醫學研究者關注的焦點。研究證實通過抑制性差減雜交技術(suppression substractive hybridization，SSH)克隆，在肺泡發生相關階段特異表達的P311基因[7]，全長2 025 bp，編碼分子質量8 kDa、由68個氨基酸組成的多肽，在人和小鼠等物種間高度保守[8]。P311廣泛表達于多種組織細胞中，是一種胞內蛋白，主要存在于胞漿，在核內亦有少量定位。P311主要參與受損神經系統的再生[9-10]、促進成纖維細胞表型轉化[8,11]，并且與腫瘤細胞的遷移、浸潤等密切相關[12-13]。P311在肺組織中主要定位于肺泡壁及肺泡隔膜生長點處，相對于成熟肺組織，P311基因及編碼蛋白在原始肺泡期到肺泡形成初期的表達明顯升高，而后在肺泡期達到最高峰，并在整個肺泡形成階段保持高水平表達，這些結果均提示P311可能與肺泡形成有關。研究還顯示，高表達P311的肺成纖維細胞可轉分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞在肺泡發育及再生過程中及肺泡隔膜的形成中起著重要的作用，如次級隔膜發生及肺泡重建所必需的彈性蛋白均由肌成纖維細胞產生，提示P311在防止肺損傷或對受損肺組織的修復中發揮重要的作用。本研究將小鼠置于高濃度氧氣環境中，小鼠第3天開始肺組織形態學發生改變，至第14天時可見不同程度的肺損傷，隨著吸入高濃度氧氣時間的延長,早期為炎性反應, 后期肺泡結構逐漸簡單化、纖維化[14-15]。本實驗成功建立高氧肺損傷小鼠模型，并通過免疫組化、real-time PCR及ELISA方法，檢測到P311主要表達于肺泡壁及肺泡隔膜生長點處，與空氣組比較，隨著吸入高濃度氧氣時間的延長肺損傷加重，P311 mRNA和蛋白表達均高于同時段空氣對照組，并于高氧肺損傷發生的第7～14天時達高峰。實驗提示P311基因可能是肺損傷修復的新的調控因子，可能通過調節肺泡Ⅱ型上皮細胞和肺成纖維間質細胞再生和轉分化，促進肺泡分隔膜的形成，抑制肺間質纖維化形成來影響肺的修復。

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(2015-07-20收稿，2015-10-07修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

The Dynamic Change and Significance of Alveoli-Forming GeneP311 Expression in Hyperoxia-induced Lung Injury

ZENG Baomei1, WANG Yuchuan2, HUANG Dong2

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore expression and significance of P311 gene of alveoli forming. Method: Sixty days old adult KM mice were divided into air group and hyperoxia group. Mice of air group were fed in the ordinary room air while mice of hyperoxia group were fed in oxygen chamber of the same room and continuously inhaled high concentration medical oxygen(oxygen concentration>90%). After 1, 3, 7and 14 days, the lung tissues were taken to observe histopathological changes by hematoxylin-eosin staining and check whether the model building was successful or not. The expression of P311 mRNA level and the P311 protein location were detected by real-time PCR and immunohistochemistry respectively, and protein content of P311 was detected by ELISA. Result: In hyperoxia group, with extension of time of inhalation of high-concentration oxygen, the lung tissue pathological changes aggravated gradually, which meant hyperoxia-induced lung injury model building was successful. Immunohistochemical staining of lung tissue showed that P311 was mainly located in the alveolar walls and alveolar septum growing point in the lung tissue, and took on weak positive reaction in air group but strong positive reaction in the high oxygen group. Compared with air group, P311 gene expression and protein content were significantly higher in hyperoxia group. Besides, with extension of time of inhalation of high-concentration oxygen, P311 gene expression and protein content increased gradually and reached the peak on 7thday (P<0.05). Conclusion: P311 gene expression is upregulated in hyperoxia-induced lung injury.

[Key words]alveoli-forming gene; gene expxession; hyperoxia; lung injury; mice

[中圖分類號]R34-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)01-0027-05

*[基金項目]貴州省科技廳科研項目[黔科合J字(2011)2250號]

**通信作者 E-mail:hd522523@163.com網絡出版時間：2015-07-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150701.2038.031.html