胍基乙酸的致突變性研究

代重山， 馬 佳， 王澤明， 田耀耀， 張德福， 楊立彬， 湯樹生*

（1.中國農業大學 農業部獸藥安全監督檢驗測試中心（北京），北京海淀 100193；2.固安君德同創生物工程有限公司，河北固安 065500；3.北京君德同創農牧科技股份有限公司，北京海淀 100085）

胍基乙酸的致突變性研究

代重山1， 馬 佳2， 王澤明3， 田耀耀3， 張德福3， 楊立彬3， 湯樹生1*

（1.中國農業大學 農業部獸藥安全監督檢驗測試中心（北京），北京海淀 100193；2.固安君德同創生物工程有限公司，河北固安 065500；3.北京君德同創農牧科技股份有限公司，北京海淀 100085）

本文選用Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗三種短期測試組合探究胍基乙酸是否具有致突變作用。結果發現：Ames試驗結果顯示，胍基乙酸在8～5000 μg/皿，有或無代謝活化系統（S9）時，對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四種試驗株均沒有誘變性；骨髓細胞微核試驗結果顯示，胍基乙酸在1250～5000 mg/kg體重劑量內經口染毒后，各劑量組小鼠骨髓細胞中嗜多染紅細胞（PCE）微核率與陰性對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05）；小鼠精子畸形試驗結果顯示，胍基乙酸在1250～5000 mg/kg體重劑量內經口染毒后，各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明，三個致突變試驗結果均為陰性，胍基乙酸為非致突變物質。

胍基乙酸；飼料添加劑；致突變

胍基乙酸又稱胍乙酸、N－咪基甘氨酸，是動物體內合成肌酸（Cr）的主要內源性前體物質，而Cr是動物機體能量代謝中的重要物質，是能量的貯存場所（張俊玲等，2016）。已有研究表明，在日糧中補充胍基乙酸能夠提高畜禽生長性能和胴體品質，從而提高生產效益（張德福等，2016；Michiels等，2012；張堂田等，2011;江濤等，2011）。也有研究發現，外源性補充胍基乙酸可增加人和動物血液及肌肉組織內Cr水平，且更加優越于直接補充Cr（Ostojic等，2016；McBreairty等，2015）。近期研究證實，日糧中添加0.04%～0.08%胍基乙酸可改善肉種雞種蛋孵化性能 （張俊玲等，2016）；日糧中添加0.05%胍基乙酸可改善櫻桃谷肉鴨的屠宰性能和抗氧化能力（王亞瓊等，2016）。另一方面，高劑量補充胍基乙酸可誘導大鼠產生高同型半胱氨酸血癥（Liu等，2014），且存在雌雄差異，如亞急性毒性研究中發現，雌性大鼠連續90 d飼喂胍基乙酸 （1000 mg/kg飼料）可導致血漿高半胱氨酸水平明顯升高，遠遠高于雄性大鼠 （10000 mg/kg飼料）（Feedap，2009）；另外，用添加3000 mg/kg胍基乙酸的飼料飼喂肉雞35 d，雞血液中紅細胞平均體積及紅細胞血紅蛋白濃度顯著增加，表明高劑量胍基乙酸可能存在一定的毒性（Feedap，2016）。然而，關于胍基乙酸安全性及其毒理學方面的風險評估報道較少。本研究參照國內外致突變性試驗方法研究了胍基乙酸的致突變作用，以期為胍基乙酸的安全使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品 胍基乙酸（商品名為肌源?）由北京君德同創農牧科技股份有限公司提供，純度≥98%；二甲基亞砜（DMSO）、敵克松、2-氨基芴（2-AF）、疊氮鈉（NaN3），購自西格瑪公司；環磷酰胺（CP），購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），購自天津科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗動物 ICR小鼠購自于北京維通利華動物科技有限公司 （試驗動物生產許可證號SCXK（京）2007-0001），飼養于農業部獸藥安全監督檢驗測試中心（北京）實驗動物房，采用獨立通風籠盒飼養，自由采食，維持12 h光照／黑暗的節律，正式試驗前均適應喂養5 d。

1.3 Ames試驗 試驗嚴格按GB15193.4-2003標準（中華人民共和國衛生部，2004）鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）方法進行操作，試驗在同條件下重復2次。所用試驗菌株為鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102（試驗前已鑒定合格），其中，TA97和TA98可檢測移碼型誘變劑；TA100可檢測堿基置換型誘變劑；TA102檢測移碼型和堿基置換型誘變劑。試驗時先用預備試驗（點試驗）確定正式試驗（平皿摻入法）的劑量 （5000、1000、200、40 μg/皿和8 μg/皿），同時設滅菌蒸餾水和0.2%DMSO為陰性對照組及其不同的陽性對照組。上述8個試驗組均分為加代謝活化系統S9組和不加 S9組，點試驗加 S9時，TA97、TA98、TA100、TA102四種菌株均用2-AF作為陽性對照物，濃度為20.0 μg/10 μL；點試驗不加S9時，四種菌株均用敵克松作為陽性對照物，濃度為50.0 μg/皿。摻入試驗加S9時，四種菌株均用2-AF作為陽性對照物，濃度為10.0 μg/皿；摻入試驗不加S9時，菌株TA97、TA98、TA102用敵克松為陽性對照物，濃度為50.0 μg/皿，菌株TA100用NaN3為陽性對照物，濃度為1.5 μg/皿。

1.4 小鼠骨髓細胞微核試驗 選用體重25～30 g ICR小鼠100只，隨機分為5組，每組20只（雌雄各半）進行試驗，參照GB15193.5-2003標準（中華人民共和國衛生部，2004）進行。胍基乙酸分為1250、2500、5000 mg/kg三個劑量組，用1%CMCNa配成混懸液，采用經口灌胃法對試驗動物進行染毒，小鼠灌胃體積為0.2 mL/10 g體重，每天染毒1次，連續染毒2 d。在第二次染毒后6 h頸椎脫臼處死小鼠，取股骨制片。以雙盲法鏡下檢查計數嗜多染紅細胞數（PCE）、含微核多染紅細胞數及成熟紅細胞數（RBC）。試驗另設陰性對照組（1%CMCNa）和陽性對照組（CP 40 mg/kg，用生理鹽水溶解為2 mg/mL溶液）。陰性對照組染毒方法亦采用灌胃染毒方式，陽性對照組采用腹腔注射法進行染毒。陰性對照組和陽性對照組的染毒方案及隨后操作均與受試物各劑量組相同。

1.5 小鼠精子畸形試驗 選用體重25～35 g雄性ICR小鼠50只，隨機分為5組。胍基乙酸分為1250、2500、5000 mg/kg三個劑量組，用1%羧甲基纖維素鈉配成混懸液。采用經口灌胃法對試驗動物進行染毒，小鼠灌胃體積為0.2 mL/10 g體重，每天染毒1次，連續染毒5 d，在第1次給藥后第35 d頸椎脫臼法處死小鼠，摘取兩側附睪按GB15193.7-2003標準 （中華人民共和國衛生部，2004）操作方法制片。在顯微鏡下檢查精子形態，對同一視野下正常精子、各型畸形精子進行計數。試驗另設陰性對照組（1%CMC-Na）和陽性對照組（CP 40 mg/kg，用生理鹽水溶解為2 mg/mL溶液）。陰性對照組染毒方法亦采用灌胃染毒方式，陽性對照組采用腹腔注射法進行染毒。陰性對照組和陽性對照組的染毒方案及隨后操作均與受試物各劑量組相同。

2 結果

2.1 胍基乙酸對Ames試驗結果的影響 胍基乙酸2次Ames試驗的結果見表1和表2，與陰性對照組相比，加減S9活化系統，胍基乙酸濃度為8～5000 μg/皿時，4種鼠傷寒氏沙門氏菌試驗株的每皿平均回變菌落數2次重復性試驗結果無顯著差異（P＞0.05），且未見劑量反應關系。

2.2 胍基乙酸對小鼠骨髓細胞微核試驗的影響胍基乙酸小鼠骨髓細胞微核試驗結果見表3和表4，與陰性對照組（1%CMC-Na）相比，陽性對照物CP處理可顯著提高小鼠PCE微核率（P＜0.01），胍基乙酸各劑量組PCE/RBC在正常范圍內，無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 胍基乙酸對小鼠精子畸形試驗的影響 胍基乙酸小鼠精子畸形試驗試驗結果見表5和表6，胍基乙酸各劑量組精子畸形率與陰性對照組差異不顯著（P＞0.05），精子畸形主要表現為無鉤、頸扭轉和無定形等；與陰性對照組（1% CMC-Na）相比，陽性對照組（CP）顯著提高精子畸形率（P＜0.01）。

表1 胍基乙酸對鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果的影響（第1次）

表2 胍基乙酸對鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗結果的影響（第2次）

表3 胍基乙酸對小鼠骨髓細胞微核試驗結果的影響（雌性小鼠）

表4 胍基乙酸對小鼠骨髓細胞微核試驗結果的影響（雄性小鼠）

表5 胍基乙酸對小鼠精子畸形率的影響

表6 各類畸形精子百分率%

3 分析與討論

胍基乙酸是甘氨酸的衍生物，作為肌酸的前體物，可在動物或人體內自然生成，在機體的能量循環中發揮著重要作用 （Ostojic等，2016；McBreairty等，2015）。本研究選擇了Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗三種短期測試組合檢測胍基乙酸的致突變作用，符合《食品安全性毒理學評價程序和方法》（2003）中致突變性測定要求。歐洲食品安全局報告（2009），使用平皿法檢測胍基乙酸在62～5000 μg/皿時對鼠傷寒沙門氏菌 TA102、TA100、TA98、TA97a、TA1535的致突變作用，結果均為陰性，本研究結果與其一致。在使用人周圍淋巴細胞的測試中，0.01 M胍基乙酸處理20 h不會造成染色體異常（Feddap，2009）。此外，本研究進一步采用了小鼠體內試驗方法，檢測了胍基乙酸的致突變性及遺傳毒性，發現小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠睪丸精子畸形試驗結果均為陰性，進一步證實胍基乙酸為非致突變物質。胍基乙酸的非致突變性結果一方面可能與胍基乙酸是機體內源性物質有關，因為胍基乙酸可在動物或人體內自然生成，具有較好的安全性；另一方面可能與其高穩定性結構有關（韋長梅，2004）。

4 小結

體外及動物試驗證實，動物飼料添加劑胍基乙酸是一種非致突變物質。

[1]江濤.胍基乙酸的合成及其對肉雞生長性能和血液理化指標的影響[D].合肥：安徽農業大學，2012.

[2]王亞瓊，劉強，姜發彬，等.胍基乙酸對櫻桃谷肉鴨生產性能和抗氧化能力的影響[J].2016，39（2）：269～274

[3]韋長梅.胍基化合物的合成與晶體結構研究：[碩士學位論文][D].南京：南京工業大學，2004.

[4]張德福，田耀耀，馬佳，等.胍基乙酸對AA肉仔雞生長性能和經濟效益的影響[J].飼料研究，2016，17：32～36

[5]張俊玲，張德福，崔軍，等.胍基乙酸對AA+肉種雞繁殖性能的影響[J].飼料研究，2016，14：25～28

[6]張俊玲，張德福，石鳳云，等.胍基乙酸在動物生產上的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2016，52（4）：63～66.

[7]張堂田，孟秀麗，江濤，等.胍基乙酸和N-甲基-D-天冬氨酸對育肥豬生長和肉品質的影響[J].湖南農業科學，2011，23：121～123

[8]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.7-2003.食品安全性毒理學評價程序和方法[S].北京：中國標準出版社，2004.

[9]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.4-2003.食品安全性毒理學評價程序和方法[S].北京：中國標準出版社，2004.

[10]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.5-2003.食品安全性毒理學評價程序和方法[S].北京：中國標準出版社，2004.

[11]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.1-21-2003.食品安全性毒理學評價程序和方法[S].北京：中國標準出版社，2004.

[12]Feedap.Safety and efficacy of guanidinoacetic acid as feed additive for chickens for fattening[J].EFSA Journal，2009，998：1～30.

[13]Feedap.Safety and efficacy of guanidinoacetic acid for chickens for fattening，breeder hens and roosters，and pigs[J].EFSA Journal 2016，14（2）：4394.

[14]Liu Y Q，Jia Z，Han F，et al.Suppression effects of betaine-enriched spinach on hyperhomocysteinemia induced by guanidinoacetic acid and choline deficiency in rats[J].Scientific World Journal，2014，2014：904501.

[15]McBreairty L E，Robinson J L，Furlong K R，et al.Guanidinoacetate is more effective than creatine at enhancing tissue creatine stores while consequently limiting methionine availability in Yucatan miniature pigs[J].PLoS One.2015，10（6）：e0131563.

[16]Michiels J，Maertens L，Buyse J.Supplementation of guanidinoacetic acid to broiler diets：Effects on performance，carcass characteristics，meat quality，and energy metabolism[J].Poultry Sci，2012，91（2）：402～412.

[17]Ostojic S M，Ostojic J，Drid P，et al.Guanidinoacetic acid versus creatine for improved brain and muscle creatine levels：a superiority pilot trial in healthy men[J].Appl Physiol Nutr Metab，2016，41（9）：1005～1007.■

The present study was aimed to investigate the mutagenicity of guanidinoacetic acid（GA）by using Ames test，mouse bone marrow micronucleus test and mouse sperm shape abnormality test.The results showed that，compared to the negative control group，the treatment of GA at the range of 8～5000 μg/dish did not induced the marked mutation for Salmonella typhimurium strains TA97，TA98，TA100and TA102with or without metabolic activation system （S9）.In the mouse bone marrow micronucleus test and mouse sperm shape abnormality test，there are both no significant difference observed in all the GA treatment（1250～5000 mg/kg）groups，compared to the negative control group（P＞0.05）.These results revealed that GA is a non-mutagenic substance.

guanidinoacetic acid；feed additive；mutagenicity

S811

A

1004-3314（2017）03-0016-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170305

北京市科技計劃項目（Z151100001215001）

*通訊作者