SDF-1-CXCR4/CXCR7信號對脂肪干細胞促血管新生能力的影響

李強　張林霞　張愛君　陶常波　李雪陽　馬志兵　金培生

?

SDF-1-CXCR4/CXCR7信號對脂肪干細胞促血管新生能力的影響

李強張林霞張愛君陶常波李雪陽馬志兵金培生

【摘要】目的研究SDF-1對ADSCs體外促血管新生能力的影響，并探討CXCR4、CXCR7在其中的作用。方法體外培養ADSCs，檢測其CXCR4、CXCR7的表達；SDF-1刺激ADSCs，并分別加入CXCR4、CXCR7封閉抗體，檢測ADSCs-CM中VEGF、HGF、β-FGF含量，及其對hUVECs微血管形成的影響。結果成功培養ADSCs；ADSCs體外培養傳代過程中CXCR4、CXCR7表達持續下降；SDF-1刺激上調CXCR4、CXCR7表達，并提高ADSCs對血管活性因子的分泌，及促進hUVEC微血管的形成；封閉CXCR4、CXCR7均可顯著抑制SDF-1的促進作用。結論體外環境下，SDF-1可上調ADSCs中CXCR4、CXCR7表達，并通過SDF-1-CXCR4/CXCR7兩條通路提高ADSCs的促血管新生能力。

【關鍵詞】脂肪干細胞基質細胞衍生因子-1血管新生

脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是來自脂肪組織基質的成體干細胞，含量豐富，獲取及培養方法簡單，可向脂肪、骨、軟骨、神經等多個細胞系分化[1]；且具有血管內皮細胞分化潛能[2]，可分泌多種因子促進血管新生（Angiogenesis）及組織修復[3]，在再生醫學及組織工程領域應用廣泛[4]。

基質細胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor -1，SDF-1）是重要的細胞趨化因子，通過受體CXCR4、CXCR7可動員多種細胞參與血管新生[5]。我們前期研究證實，ADSCs可分泌SDF-1，促進HUVEC形成微血管[6]。有報道認為，SDF-1可作為旁分泌因子作用于ADSCs本身，提高其活性[7-8]。SDF-1對ADSCs的分泌及促血管新生能力影響的研究尚未見報道。本實驗旨在探討SDF-1及其受體CXCR4、CXCR7 對ADSCs促血管新生能力的影響，為增強ADSCs在組織工程產品血管化，及缺血性疾病干細胞治療方面的作用，提供新的理論依據。

1　實驗材料

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）購自中國醫學科學院。

胎牛血清+L-DMEM（Gibco，美國）；PE-鼠抗人CD29（Serotec，英國）；PE-鼠抗人CD106（BD，美國）；FITC-鼠抗人CD34（Miltenyi Biotee，德國）；FITC-鼠抗人CD44、CD49d、CD80（Serotec，英國）；兔抗人CXCR4、CXCR7、β-actin（Cell Signaling Technology，美國）；Matrigel TM4凝膠（BD Biosciences，美國）；RPMI-1640（Gibco，美國）；ELISA試劑盒（R&D，美國）。

2　實驗方法

2.1ADSCs獲取、培養及鑒定

選取3例30～45歲健康女性腹部吸脂患者，經醫院倫理委員會批準，患者知情同意。以酶消化法獲取原代ADSCs，10%胎牛血清+L-DMEM 37℃、5% CO2孵育，0.2%胰酶消化傳代[6,10]。

細胞表面標記物檢測：第3代ADSCs 1×105個，流式細胞儀檢測細胞表面標志物，按常規進行。一抗為PE-鼠抗人CD29、CD106單克隆抗體，FITC-鼠抗人CD34、CD44、CD49d、CD80單克隆抗體。

細胞分化能力檢測：98 mL DMEM+10%FBS+ 100 μL β-磷酸甘油+1 mL地塞米松+1 mL Vit-C誘導28 d，茜素紅鈣結節染色檢測成骨分化能力。DMEM+10%FBS+25 μg/L EGF+5 μg/L ATRA+5 μg/L FGF+5 μg/L胰島素+0.4 μg/mL氫化可的松+20 mg/L谷氨酰胺誘導8 d，細胞角蛋白免疫組化染色檢測成表皮分化能力。

2.2CXCR4、CXCR7表達水平檢測

Western blot：原代至第3代ADSCs各1×106個，細胞裂解后提取總蛋白。25 μL上樣，120 g/L SDSPAGE凝膠電泳并轉移至PVDF膜，Western blot檢測，一抗為兔抗人CXCR4、CXCR7、β-actin單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，生物素-親和素標記系統檢測。照相后ImgaeJ軟件分析條帶灰度值。

流式細胞計數：原代至第3代ADSCs 1×105個，流式細胞儀檢測CXCR4、CXCR7表達，方法同上。

2.3SDF-1刺激對CXCR4、CXCR7表達影響

3)新型擴孔鉆頭的綜合性能有明顯的提高，擴孔后其井徑均大于170 mm，定向鉆井造斜率達到9.9°/30 m，鉆頭平均進尺達到93 m，機械鉆速為1.24 m/h,與國外同類鉆頭相比，進尺提高50%，機械鉆速提高4%。

取處于對數生長期的第3代ADSCs，LDMEM+1%胎牛血清+0.5 mg/L SDF-1培養2 d，Western blot、流式細胞計數檢測CXCR4、CXCR7表達水平。

2.4SDF-1-CXCR4/CXCR7對ADSCs分泌功能的影響

第4代ADSCs接種于6孔板，常規培養至細胞70%融合。實驗分5組：SDF-1刺激組，以LDMEM+1%胎牛血清+0.5 mg/L SDF-1培養；CXCR4封閉組、CXCR7封閉組，先以10 mg/L CXCR4或CXCR7抗體封閉2 h，再加入SDF-1；CXCR4、CXCR7封閉組，同時加入兩種抗體；對照組L-DMEM+ 1%胎牛血清培養。2 d后收集條件培養基（ADSCs-CM），離心后取上清，過濾、分裝備用。各取200 μL ADSCs-CM，ELISA法檢測VEGF、HGF、β-FGF含量，步驟按說明書進行。

2.5SDF-1-CXCR4/CXCR7對ADSCs促hUVEC微血管形成的影響

48孔板，每孔100μL冷MatrigelTM4凝膠，37℃、5%CO230 min。hUVECs每孔2×104個接種于48孔板。分別加入各組ADSCs-CM 75 μL及RPMI-1640+1%胎牛血清25 μL。12 h后取下室細胞，多聚甲醛固定，鏡下觀察。Weidner法[9]計數管樣毛細血管數量及密度，選微管密度最高的5個視野，200倍鏡下觀察計數，以對照組為基點（100%）。

2.6數據統計分析

所有實驗重復3次。以SPSS 16.0行統計學分析，數據用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1ADSCs培養與鑒定

經體外培養后獲取可連續傳代的細胞群體，呈類似成纖維細胞的長梭形；流式細胞檢測證實，細胞表面CD34、CD80、CD106陰性，CD29、CD44、CD49d陽性；成骨誘導28 d后，茜素紅染色可見散在紅色結節；成表皮誘導8 d后，部分細胞變為圓形或不規則形，呈鋪路石樣排列，部分細胞角蛋白陽性表達（圖1）。

圖1　ADSCs體外培養與鑒定Fig.1Culture and identification of ADSCs in vitro

3.2ADSCs表面CXCR4、CXCR7表達變化

流式細胞計數發現，CXCR4、CXCR7表達水平隨體外傳代次數增加而逐漸降低（CXCR4、CXCR7陽性率原代為51.4%和80.3%；第1代為23.27%和19.44%；第2代為5.35%和3%；第3代為2.54%和1.89%）；SDF-1刺激可上調CXCR4、CXCR7的表達（CXCR4、CXCR7陽性率分別為35.11%和27.6%）；Western blot免疫印跡檢測并用ImgaeJ軟件分析條帶灰度，結果與流式細胞計數一致（圖2）。

圖2　ADSCs表面CXCR4、CXCR7的表達Fig.2CXCR4 and CXCR7 expression in ADSCs

Western blot及流式細胞檢測均證實，原代ADSCs表面CXCR4、CXCR7呈陽性表達，傳代后兩者的表達迅速降低，至第3代時均為陰性。0.5 mg/L SDF-1刺激2 d后，CXCR4和CXCR7的表達均顯著提高。

3.3SDF-1-CXCR4/CXCR7對ADSCs分泌功能的影響

各組ADSCs-CM中均檢測到VEGF、HGF和β-FGF。SDF-1刺激組中三者含量均顯著上升，CXCR4、CXCR7抗體封閉組較SDF-1刺激組有所降低，同時封閉兩者后降至對照組水平（圖3）。

圖3　ADSCs分泌功能檢測Fig.3The secretion of VEGF,HGF and β-FGF from ADSCs performed by ELISA

由此可見，SDF-1能促進ADSCs對VEGF、HGF 和β-FGF分泌，CXCR4、CXCR7抗體封閉能部分逆轉該促進作用，同時使用兩種抗體則可抵消SDF-1的促進作用。

3.4SDF-1-CXCR4/CXCR7對ADSCs促hUVECs微血管形成的影響

SDF-1刺激組hUVECs毛細血管形成的數量及管狀結構完整性較對照組高，CXCR4、CXCR7阻斷組中血管數量較SDF-1刺激組有所降低，同時阻斷組小管形成能力降至對照組水平（圖4）。

圖4　ADSCs促HUVECs小管形成作用Fig.4 ADSCs promote tube formation of hUVECs

4　討論

近年來，間充質干細胞（MSCs）在組織工程及再生醫學領域應用極為廣泛。組織工程植入物的存活及抗感染能力的獲得，很大程度上取決于血運恢復情況[10]，損傷組織的修復更是依賴于干細胞所分泌的血管活性因子的作用[11]。因此，用于構建組織工程產品及干細胞治療的種子細胞需具有一定的促血管新生能力。ADSCs是新發現的MSCs，不僅能分化為血管內皮及平滑肌細胞，直接參與血管重建[2]，還可分泌大量活性因子促進血管新生[3]。我們的前期研究和本實驗均證實ADSCs可分泌VEGF、HGF、β-FGF等，有利于血管新生和組織修復[6]。

ADSCs要發揮作用必需移植到受損組織中，此時將面對缺氧、氧化應激及炎癥等不利環境，常導致細胞的活性降低及死亡，嚴重影響療效[12]，需對ADSCs進行一定干預，以增強細胞活性，提高其修復能力。低氧誘導[13]、基因修飾[14]均被證實可一定程度提高ADSCs促血管新生能力。但基因修飾的安全性及穩定性仍存疑，低氧誘導可能會降低干細胞分化能力。因此需探尋新的簡單有效的ADSCs預處理方案。

1993年，Tashiro等[15]首次發現趨化因子SDF-1，并克隆出其蛋白結構。SDF-1與其受體CXCR4、CXCR7結合，可動員造血干細胞、內皮祖細胞和RBCCs（Recruited bone marrow-derived circulating cells）等參與血管新生，是重要的血管重建通路[5]。對MSCs同樣具有較強的動員、趨化作用。Liu等[16]證實，SDF-1可增強BMSCs增殖、分泌功能，促進腎缺血再灌注損傷修復。Kim等[7]證實SDF-1可動員并活化ADSCs，促進創面愈合。但SDF-1對ADSCs分泌及促血管新生能力的影響尚未見報道。我們用SDF-1處理ADSCs，發現其分泌及促hUVEC小管形成能力均顯著增強。SDF-1可刺激ADSCs分泌血管活性因子，從而促進hUVECs微血管形成，提示在局部移植或靜脈輸入ADSCs之前，以一定濃度的SDF-1預處理，可增強細胞促血管新生能力，以求更好的療效。

SDF-1的兩個受體CXCR4和CXCR7所介導的生物學效應不盡相同。SDF-1/CXCR4軸的激活能促進BMSCs趨化遷移，CXCR7則更多與BMSCs增殖能力相關[16]。為研究兩者在ADSCs中的作用，我們首先檢測了CXCR4、CXCR7在ADSCs中的表達情況，發現兩者在原代ADSCs中陽性表達，但隨著體外培養傳代次數的增加，其表達呈快速下降，至第3代則為陰性。其原因可能為：①胰蛋白酶消化時破壞了細胞表面蛋白；②體外培養環境與體內有所差異，尤其是氧分壓不同，影響受體的表達。體外培養的ADSCs中CXCR4和CXCR7水平過低，可能會影響其在體內的歸巢及修復能力，用脂質體[17]或慢病毒[18]對其進行基因修飾，可維持較高的受體水平，低氧誘導也是可行的方案。本實驗中，我們發現SDF-1刺激同樣可提高CXCR4和CXCR7的表達。SDF-1可誘導其受體表達，這種正反饋效應與其他細胞因子（如VEGF等）相似，提示SDF-1刺激ADSCs可提高CXCR4和CXCR7的表達，提高細胞遷移歸巢能力。

我們進一步用CXCR4和CXCR7的中和抗體，分別封閉兩條通路，發現阻斷CXCR4、CXCR7均能不同程度的抑制SDF-1所引發的ADSCs分泌及促微血管形成能力的提高，同時阻斷兩者后ADSCs促血管新生能力降至正常。可見SDF-1-CXCR4/CXCR7軸在ADSCs的分泌及促微血管形成中具有重要作用。

綜上，本研究證實，體外環境下SDF-1刺激可上調ADSCs中CXCR4和CXCR7的表達，并能提高ADSCs對血管活性因子的分泌，以及對hUVECs小管形成的促進，該效應是通過SDF-1-CXCR4/CXCR7兩條通路共同完成的。

參考文獻

[1]Zhu Y,Liu T,Song K,et al.Adipose-derived stem cell:A better stem cell than BMSC[J].Cell Biochem Funct,2008,26:664-675.

[2]Fraser JK,Schreiber R,Strem B,et al.Plasticity of human adipose stem cells toward endothelial cells and cardiomyocytes[J].Nat Clin Pract Cardiovasc Med,2006,3 Suppl 1:S33-S37.

[3]Nakao N,Nakayama T,Yahata T,et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells facilitate hematopoiesis in vitro and in vivo:advantages over bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Am J Pathol,2010,177(2):547-554.

[4]Konno M,Hamabe A,Hasegawa S,et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells and regenerative medicine[J].Dev Growth Differ,2013,55(3):309-318.

[5]Ruiz de Almodocar C,Luttun A,Carmeliet P.An SDF-1 trap for myeloid cells stimulates angiogenesis[J].Cell,2006,124(1):18-21.

[6]Li Q,Li PH,Hou DJ,et al.EGF Enhances ADSCs Secretion via ERK and JNK Pathways[J].Cell Biochem Biophys,2014,69(1): 189-196.

[7]Kim WS,Park BS,Sung JH.The wound-healing and antioxidant effects of adipose-derived stem cells[J].Expert Opin Biol Ther, 2009,9(7):879-887.

[8]Giuliana DR,Antonietta G,Annalisa A,et al.Enhanced healing of diabetic wounds by topical administration of adipose tissuederived stromal cells overexpressing stromal-derived factor-1: biodistribution and engraftment analysis by bioluminescent imaging [J].Stem Cells International,2010,2011:304562.

[9]Chen F,Bai J,Li W,et al.RUNX3 suppresses migration,invasion and angiogenesis of human renal cell carcinoma[J].PLoS One, 2013,8(2):e56241.

[10]Polykandriotis E,Arkudas A,Horch RE,et al.Autonomously vascularized cellular constructs in tissue engineering:opening a new perspective for biomedical science[J].J Cell Mol Med, 2007,11(1):6-20.

[11]Zhang M,Mal N,Kiedrowski M,et al.SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction[J].FASEB J,2007,21(12):3197-3207.

[12]Das R,Jahr H,van Osch GJ,et al.The role of hypoxia in bone marrow-derived mesenchymal stem cells:considerations for regenerative medicine approaches[J].Tissue Eng Part B Rev, 2010,16(2):159-168.

[13]Liu H,Xue W,Ge G,et al.Hypoxic preconditioning advances CXCR4 and CXCR7 expression by activating HIF-1a in MSCs [J].Biochem Biophys Res Commun,2010,401(4):509–515.

[14]Shevchenko EK,Makarevich PI,Tsokolaeva ZI,et al.Transplantation of modified human adipose derived stromal cells expressing VEGF165 results in more efficient angiogenic response in ischemic skeletal muscle[J].J Transl Med,2013,11:138.

[15]Tashiro K,Tada H,Heilker R,et al.Signal sequence trap:a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins[J].Science,1993,261(5121):600-603.

[16]Liu H,Liu S,Li Y,et al.The role of SDF-1-CXCR4/CXCR7 axis in the therapeutic effects of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells for renal ischemia/reperfusion injury[J].PLoS One, 2012,7(4):e34608.

[17]Gheisari Y,Azadmanesh K,Ahmadbeigi N,et al.Genetic modification of mesenchymal stem cells to overexpress CXCR4 and CXCR7 does not improve the homing and therapeutic potentials of these cells in experimental acute kidney injury[J].Stem Cells Dev,2012,21(16):2969-2980.

[18]Gul-Uludag H,Xu P,Marquez-Curtis LA,et al.Cationic liposomemediated CXCR4 gene delivery into hematopoietic stem/progenitor cells:implications for clinical transplantation and gene therapy [J].Stem Cells Dev,2012,21(10):1587-1596.

The Influence of Stromal Cell-derived Factor-1 Promoting Angiogenesis of Adipose-derived Stem Cells via CXCR4 and CXCR7 Pathway in vitro

LI Qiang1,2,ZHANG Linxia1,ZHANG Aijun1,TAO Changbo1,LI Xueyang1,MA Zhibing1,

JIN Peisheng1.1 Plastic Surgery Department,Xuzhou Medical College Affiliated Hospital,Xuzhou 221000,China;2 Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College&Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China. Corresponding author:JIN Peisheng(E-mail:jinps2006@163.com).

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of SDF-1 in promoting ADSCs angiogenesis,as well as CXCR4,CXCR7. MethodsADSCs were primary cultured by enzyme digestion method.Flow cytomertry and western blot assays were performed to detect the expression of CXCR4,CXCR7.ADSCs were treated with SDF-1 and neutralizing anti-CXCR4 and/or anti-CXCR7 antibody.ELISA was used to detect the secretion of VEGF,HGF,and β-FGF.hUVECs tube formation assay was used to examine the effect of SDF-1 and neutralizing antibody CXCR4,CXCR7 on promoting angiogenesis property of ADSCs.ResultsADSCs were successfully isolated and cultured from human liposuction tissue.CXCR4 and CXCR7 expression were significantly decreased during cell culture.When treated with SDF-1,CXCR4 and CXCR7 expression were significantly increased.In addition,SDF-1 pretreating also promoted the secretion of angiogenesis factors VEGF,HGF,β-FGF and increased the ability of tube formation of hUVECs induced by ADSCs.The blocking of CXCR4 and CXCR7 activation also inhibited the promotion of angiogenesis property of ADSCs caused by SDF-1.ConclusionSDF-1 pretreating can up-regulate the expression of CXCR4 and CXCR7 in ADSCs.Furthermore,it also promotes the angiogenesis ability of ADSCs through CXCR4 and CXCR7 pathways.

【Key words】Adipose-derived stem cells;Stromal cell-derived factor-1;Angiogenesis

收稿日期：（2015年11月4日；修回日期：2015年12月12日）

通信作者：金培生（E-mail：jinps2006@163.com）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.002

【中圖分類號】Q813.1+1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）01－0006－05

作者單位：221000江蘇省徐州市徐州醫學院附屬醫院整形外科（李強，張林霞，張愛君，陶常波，李雪陽，馬志兵，金培生）；100144北京市中國醫學科學院整形外科醫院（李強）。