瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞耐藥基因mdr1的研究

陳亞紅　曲淼　王文波　劉偉　武曉莉

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瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞耐藥基因mdr1的研究

陳亞紅曲淼王文波劉偉武曉莉

【摘要】目的研究瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KF）與正常皮膚組織成纖維細(xì)胞（NF）耐藥基因mdr1的表達(dá)差異。方法利用RT-PCR、免疫組化及流式細(xì)胞分析等方法，檢測(cè)瘢痕疙瘩與正常皮膚組織中成纖維細(xì)胞耐藥基因mdr1及其蛋白ABCB1的表達(dá)；并對(duì)30例不同部位瘢痕疙瘩的ABCB1蛋白表達(dá)量進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中耐藥基因mdr1及其蛋白ABCB1的表達(dá)明顯高于正常皮膚；流式細(xì)胞分析顯示，瘢痕疙瘩原代成纖維細(xì)胞中ABCB1表達(dá)率：胸部＞背部、腹部，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表達(dá)耐藥基因mdr1及其蛋白ABCB1，且較正常皮膚中的表達(dá)量增高。

【關(guān)鍵詞】瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞多藥耐藥基因

瘢痕疙瘩（Keloid）具有超過原始損傷邊界，向周圍正常組織浸潤(rùn)[1]，呈“蟹足”樣生長(zhǎng)的特性，一般無自愈傾向，且極少自發(fā)消退。單純的藥物注射、手術(shù)切除、激光或放療等治療后均易復(fù)發(fā)，生長(zhǎng)超過原瘢痕范圍[2]，具有類似腫瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn)，因此存在瘢痕疙瘩腫瘤源性學(xué)說[3-5]；然而，經(jīng)抗腫瘤藥物治療后瘢痕疙瘩仍具有一定的復(fù)發(fā)率[6]，并呈現(xiàn)出瘢痕疙瘩局部組織對(duì)治療藥物不敏感的現(xiàn)象，表明瘢痕疙瘩和腫瘤的生長(zhǎng)具有某些相似性，提示了瘢痕疙瘩可能有著與腫瘤類似的“細(xì)胞耐藥”機(jī)制存在。

關(guān)于腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，最新的學(xué)說認(rèn)為是由于腫瘤干細(xì)胞（Tumor stem cell，TSC）表達(dá)耐藥基因所致[7-8]。TSC指腫瘤中存在的少量具有自我更新能力、分化潛能，并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。TSC理論認(rèn)為，腫瘤可能是由TSC產(chǎn)生，而TSC則可能由正常組織干細(xì)胞突變形成[9]。更重要的是TSC還表現(xiàn)出對(duì)多種抗腫瘤藥物的耐藥性（表達(dá)耐藥基因），被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因。

耐藥基因是一種在細(xì)胞膜表面表達(dá)的ATP-binding cassette（ABC）家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]，這類蛋白通過ATP水解供能，逆濃度梯度將代謝產(chǎn)物、藥物、毒性物質(zhì)、染料等多種物質(zhì)泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物或染料濃度降低，而產(chǎn)生多藥耐藥及外排染料等表型[10]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族參與腫瘤多藥耐藥的成員中，研究最深入是ABCB1。ABCB1由多藥耐藥基因mdr1（multidrug resistance 1）所編碼，通過其疏水位點(diǎn)與疏水性抗腫瘤藥物，如長(zhǎng)春新堿或鹽酸米托蒽醌結(jié)合，經(jīng)ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥，這種泵出作用能夠通過ABCB1抑制劑維拉帕米（Verapamil）的作用而逆轉(zhuǎn)[11-12]。ABCB1在多種癌細(xì)胞中過表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)聚集足量藥物的主要障礙之一，超過90%的轉(zhuǎn)移癌患者臨床治療失敗與mdr1基因過表達(dá)有關(guān)[13-14]。

鑒于瘢痕疙瘩浸潤(rùn)性的生長(zhǎng)方式及治療后易于產(chǎn)生藥物耐藥性等特性，我們認(rèn)為瘢痕疙瘩中可能也存在著表達(dá)耐藥基因的細(xì)胞。本研究以正常皮膚為對(duì)照，檢測(cè)瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞耐藥基因mdr1的表達(dá)狀況，探索瘢痕疙瘩對(duì)于藥物治療產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)試劑

0.2%Ⅰ型膠原酶（Worthington，USA）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco，USA）；磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶（上海思吉生物制品有限公司）；胎牛血清（上海華美生物工程公司）；mdr1引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；ABCB1鼠抗人抗體（Chemicon，USA）；ABCB1流式檢測(cè)抗體（Ebioscience，USA）。

1.2方法

瘢痕疙瘩及正常皮膚標(biāo)本均來源于手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織，獲患者及家屬知情同意（表1）。

表1　瘢痕疙瘩與正常皮膚標(biāo)本Table 1The data of keloid and normal dermal specimens

1.2.1獲取KF和NF組織中成纖維細(xì)胞

將獲得的KF和NF組織用氯霉素、PBS各振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌條件下去除表皮和皮下脂肪組織，將KF和NF真皮部分剪至1 mm×1 mm×1 mm大小，PBS振蕩洗滌1遍后加入0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化，6～8 h（正常皮膚4～6 h）后收獲真皮層細(xì)胞。取少量細(xì)胞，加入臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行拒染試驗(yàn)，血球記數(shù)板活細(xì)胞計(jì)數(shù)。用低糖DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1×106個(gè)/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)mdr1基因在KF及NF成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

預(yù)冷的PBS沖洗KF及NF成纖維細(xì)胞2遍，各加入1 ml Trizol和4℃氯仿400 μL，劇烈振蕩10 sec，室溫下靜置15 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取0.5 mL上清于另一EP管內(nèi)，加入4℃異丙醇500 μL，混勻，靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清后加入75%乙醇1 mL，振蕩；4℃、7 500 r/min離心10 min；棄上清；50 μL 0.01%DEPC水溶解混勻，測(cè)OD值，瞬時(shí)離心。按說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和real time-PCR檢測(cè)（表2）。

表2　mdr1和β-actin的基因引物序列Table 2Gene primer sequences of mdr1 and β-actin

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ABCB1蛋白在KF及NF組織中的表達(dá)

常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，60℃烤片1 h后脫蠟，PBS沖洗3 min×3次；體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下放置15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加山羊血清30 μL阻斷非特異性抗原，室溫下15 min，傾去勿洗，滴加30 μL一抗（鼠抗人ABCB1），抗體1∶100稀釋，4℃濕盒過夜；PBS沖洗3 min×3次，滴加30 μL生物素化二抗，37℃孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB室溫下避光顯色；自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，鏡下觀察并拍照。

1.2.4流式細(xì)胞分析KF及NF組織成纖維細(xì)胞中ABCB1蛋白的表達(dá)

將KF和NF原代細(xì)胞消化后，4%FBS-PBS緩沖液重懸，濾網(wǎng)過濾為單細(xì)胞懸液，進(jìn)行記數(shù)；離心1 500 r/min，5 min；棄廢液，加入4%FBS-PBS緩沖液中稀釋，平均分裝入EP管中，每管細(xì)胞數(shù)約為0.5×106個(gè)；加入抗體，抗體1∶20稀釋，充分震蕩混勻；置于冰盒內(nèi)30 min，每隔10 min將細(xì)胞懸液震蕩混勻；30 min后，以4%FBS-PBS（500 μL/EP管）洗滌離心2次，充分洗凈殘余抗體；上流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測(cè)mdr1基因在KF和NF成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

我們對(duì)6例KF和6例NF真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，在基因水平上檢測(cè)兩者成纖維細(xì)胞中mdr1的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，KF成纖維細(xì)胞中mdr1基因表達(dá)量較高，明顯高于NF，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1　瘢痕疙瘩和正常真皮組織中mdr1的基因表達(dá)情況分析（*：P＜0.05）Fig.1The expression of mdr1 gene in keloid and normal dermis(*：P<0.05)

2.2免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ABCB1蛋白在KF和NF中的表達(dá)

我們對(duì)5例KF和3例NF進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。KF中ABCB1陽性細(xì)胞散在分布于真皮層，同一標(biāo)本不同區(qū)域的陽性細(xì)胞密度有一定差異，不同標(biāo)本間陽性細(xì)胞的比例亦有所不同，反映出KF標(biāo)本個(gè)體間差異較大；而在NF真皮層中亦存在ABCB1陽性細(xì)胞，但較稀少。對(duì)每個(gè)視野（400×）中ABCB1陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析，KF和NF中ABCB1陽性細(xì)胞數(shù)分別為（9.08±2.65）和（0.60±0.16），占比分別為（8.53±3.28）%和（1.15±0.41）%，KF中ABCB1陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于NF組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2　瘢痕疙瘩和正常真皮組織中ABCB1蛋白表達(dá)情況分析Fig.2ABCB1 protein expression in keloids and normal dermis

2.3流式細(xì)胞分析ABCB1蛋白在KF及NF成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

我們對(duì)3例KF和3例NF的原代細(xì)胞進(jìn)行了ABCB1流式分析。ABCB1在原代KF中有表達(dá)，在KF原代細(xì)胞中ABCB1的表達(dá)率較高，為（3.71± 0.71）%，而NF原代細(xì)胞中ABCB1表達(dá)率比較低，約為0.13%。總體上兩種標(biāo)本來源的原代細(xì)胞中都可以檢測(cè)到ABCB1的表達(dá)，KF組表達(dá)水平要明顯高于NF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4不同部位KF成纖維細(xì)胞中ABCB1的表達(dá)結(jié)果分析

30例KF流式細(xì)胞分析ABCB1蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示，KF原代成纖維細(xì)胞中ABCB1表達(dá)為胸部明顯高于背部和腹部，差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖3　KF、NF原代細(xì)胞中ABCB1表達(dá)水平的流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果（*：P<0.05）Fig.3ABCB1 expression in keloid fibroblasts and normal dermal fibroblasts by flow cytometry(*:P<0.05)

圖4　不同部位瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ABCB1的蛋白表達(dá)（*：P＜0.05；**：P＜0.01）Fig.4The expression of ABCB1 protein in fibroblasts of different body parts of keloid(*:P<0.05;**:P<0.01)

3　討論

瘢痕疙瘩是自發(fā)或繼發(fā)于皮膚損傷，以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的過度纖維化疾病，是人類特有的病理現(xiàn)象，好發(fā)于胸骨區(qū)、肩背部、下頜部及耳部等，且具有一定的遺傳傾向及家族聚集性[15-17]，多見于有色人種。瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)理尚未明確，治療后極易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致臨床缺乏切實(shí)有效的治療手段[18-19]，嚴(yán)重者伴有長(zhǎng)期感染，甚至惡化，造成患者極大的身心痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前雖有多種治療手段，但瘢痕疙瘩經(jīng)過各種單一治療后都易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)范圍可超過原瘢痕范圍[2]。糖皮質(zhì)激素或抗腫瘤藥物瘢痕內(nèi)注射是最為有效的治療手段，但治療一段時(shí)間后機(jī)體可能對(duì)該藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果減弱。此外，瘢痕疙瘩可以采用抗腫瘤藥物，如5-氟尿嘧啶（5-FU）、平陽霉素、秋水仙堿、絲裂霉素等進(jìn)行治療[6，22]，治療后大部分瘢痕疙瘩會(huì)出現(xiàn)萎縮，但仍存在一定的復(fù)發(fā)率，并出現(xiàn)瘢痕疙瘩局部組織對(duì)治療藥物不敏感的現(xiàn)象，提示瘢痕疙瘩可能存在與腫瘤類似的“細(xì)胞耐藥”機(jī)制[23]。

關(guān)于腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，最新的學(xué)說認(rèn)為是由于腫瘤干細(xì)胞（Tumor stem cell，TSC）表達(dá)耐藥基因所致[7-8]，即TSC表現(xiàn)出對(duì)多種抗腫瘤藥物的耐藥性（表達(dá)耐藥基因）。腫瘤對(duì)化療藥物固有或獲得性耐受，是阻礙化療成功的巨大障礙。在腫瘤耐藥基因的研究中，以對(duì)ABC蛋白家族的研究較為深入。ABC蛋白家族為細(xì)胞膜上的藥物流出泵，在細(xì)胞耐藥機(jī)制中起重要作用[24]。例如，急性白血病的化療失敗與癌細(xì)胞ABCB1，ABCB2及米托蒽醌耐藥蛋白（Mitoxantrone resistance protein，MXR）的過表達(dá)密切相關(guān)[25-26]。近年來，隨著對(duì)ABCB1研究的深入，ABCB1被公認(rèn)為導(dǎo)致多種細(xì)胞耐藥的蛋白，運(yùn)用藥物SCI-1776阻斷ABCB1的表達(dá)，可以提高癌癥化療成功率[27]。而Song等[23]發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和米多蒽醌存在耐藥性，提示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞可能也存在耐藥基因的過表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，mdr1基因在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，提示瘢痕疙瘩的發(fā)病和復(fù)發(fā)可能與耐藥基因mdr1的過表達(dá)有關(guān)；此外，免疫組化及流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩比正常皮膚組織含有更多ABCB1陽性細(xì)胞，說明KF對(duì)抗腫瘤藥物的耐受很可能與ABCB1的表達(dá)有關(guān)。ABCB1陽性細(xì)胞亞群在瘢痕疙瘩的發(fā)病中可能具有重要的意義，該亞群可能是瘢痕疙瘩組織中的瘢痕疙瘩干細(xì)胞，正是由于該群細(xì)胞的存在，造成瘢痕疙瘩出現(xiàn)耐藥性和高復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)等特點(diǎn)。

對(duì)發(fā)生在機(jī)體不同部位的瘢痕疙瘩，流式分析發(fā)現(xiàn)，胸部的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞ABCB1表達(dá)陽性率最高，人體胸部張力相對(duì)較高[28]，是瘢痕疙瘩最易發(fā)生的部位，說明瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ABCB1的表達(dá)可能與瘢痕疙瘩的生長(zhǎng)環(huán)境有一定的聯(lián)系，張力較大的環(huán)境利于瘢痕疙瘩干細(xì)胞的生長(zhǎng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們選取患者胸部的瘢痕疙瘩成纖維原代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選，篩選出ABCB1陽性和陰性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，但細(xì)胞活力差，懸浮在培養(yǎng)皿中，未能繼續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證ABCB1陽性細(xì)胞是否就是瘢痕疙瘩干細(xì)胞。

結(jié)合本研究，我們認(rèn)為瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的增強(qiáng)可能與瘢痕疙瘩的耐藥性相關(guān)。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與瘢痕疙瘩干細(xì)胞之間的關(guān)系及其在瘢痕疙瘩發(fā)病中的作用，需要深入研究，以揭示瘢痕疙瘩耐藥及易復(fù)發(fā)的機(jī)制，為瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

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Research of Drug Resistance Gene MDR1 in Keloid Fibroblasts

CHEN Yahong,QU Miao,WANG Wenbo,LIU Wei,WU Xiaoli.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 20001l,China.Corresponding author:WU Xiaoli(E-mail:wuxiaoli528@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo compare the expression of drug resistance gene mdr1 between keloid fibroblast(KF)and normal dermal fibroblast(NF).MethodsThe expression of drug resistance gene mdr1 and its corresponding protein ABCB1 in KF and NF were assessed with real-time PCR,immunohistochemical and flow cytometry.The expression of ABCB1 protein in 30 cases of keloid was analyzed by flow cytometry.ResultsThe expression of mdr1 and ABCB1 in keloid was significantly higher than in normal skin;The expression rate of ABCB1 of the primary fibroblasts in pectoral keloid was higher than in abdominal and dorsal keloid.ConclusionDrug resistance gene mdr1and its corresponding protein ABCB1are all expressed in KF,and the expression amount is much higher than in NF.

【Key words】Keloid;Fibroblast;Multi-drug resistance gene

收稿日期：（2015年12月4日；修回日期：2015年12月23日） （2015年11月15日；修回日期：2015年12月28日）

通信作者：武曉莉（E-mail：wuxiaoli528@126.com）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.003

【中圖分類號(hào)】R619+.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）01－0011－05

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。