金線蓮組培快繁條件的優化

肖小君，王曼丁，曾楨迦，唐正義＊

（1．內江師范學院生命科學學院，四川內江641100；2．成都市樹德中學（光華校區），四川成都610031）

金線蓮組培快繁條件的優化

肖小君1，王曼丁2，曾楨迦1，唐正義1＊

（1．內江師范學院生命科學學院，四川內江641100；2．成都市樹德中學（光華校區），四川成都610031）

為優化金線蓮快繁技術體系以批量生產金線蓮，以其無菌苗為外植體，MS為基本培養基，附加不同濃度的植物激素（6－BA，NAA，IBA）、蔗糖及活性炭等研究金線蓮不定芽增殖、生根的影響，并進行移栽試驗。結果表明：金線蓮不定芽增殖培養以MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L的效果較佳，生根培養以1／2MS＋IBA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L的效果較好，較適移栽基質為珍珠巖∶泥炭土∶松樹皮＝1∶1∶1，成活率達98%。

金線蓮；組織培養；快速繁殖

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，多生長在海拔500～1 600m的陰濕森林或竹林內［1］。其株型小，葉形優美，葉脈金黃色呈網狀，除具有很高的觀賞價值外，還有藥王、金草、神藥、烏人參等美稱，可全草入藥，是名貴珍稀的中草藥［2］，具有廣闊的開發利用前景。

金線蓮的種子發育不全，由于其對生態環境要求嚴格，在野生自然條件下萌發率和繁殖率都極低［3］，加之近年來，野生資源不斷遭到破壞性采挖，以致處于瀕臨滅絕之地［4］。隨著藥效學和臨床應用對金線蓮研究的深入，對金線蓮藥用價值的認識進一步提高，導致金線蓮的市場需求壓力增大。目前，雖然金線蓮的組培快繁技術在各個環節的研究已有報道［5－8］，但不同基因型植物其繁殖體系還不穩定，工廠化、規模化的生產技術還有待進一步研究。因此，筆者結合當地公司產業化生產需要，以無菌苗為試材，應用正交設計試驗著重研究植物生長調節劑及蔗糖濃度對不定芽增殖與生根的影響，優化金線蓮組織培養快繁條件，旨在為金線蓮組培苗的工業化生產提供技術參考。

1材料與方法

1．1材料

選用長勢一致的金線蓮無菌植株作為試驗材料，由內江師范學院生命科學學院植物組培室提供。

1．2不定芽增殖培養的激素濃度篩選

以MS作為基礎培養基，采用3因素3水平正交設計試驗方案L9（33）（表1），選取生長健壯，大小一致的金線蓮不定芽接入9種培養基中，每種培養基均加入瓊脂粉5．5g／L，pH 5．8左右，其中每個配方接種6瓶，每瓶接種6株不定芽。培養條件：溫度白天（23±2）℃、夜間（20±2）℃，光照時間14 h／d，光照強度2 000lx，室內通氣條件良好。每周觀察不定芽的增殖情況，40d后觀察并統計增殖后總芽數、增殖倍數及不定芽生長情況。

表1 金線蓮不定芽增殖正交試驗設計L9（33）Table 1 Orthogonal test L9（33）of A．roxburghii adventitious buds proliferation

1．3生根誘導培養

一般低濃度的無機營養成分有利于組培苗的根誘導［7］。在前期試驗的基礎上，設置6種生根培養基進行優化篩選。以1／2MS為基本培養基，選取長2～3cm，有2～3片葉的叢生芽，切割成單芽，接種到添加不同濃度IBA和NAA生根誘導培養基中（表2），每個處理接種6瓶，每瓶接種6株單芽，40d后統計生根情況。接種方法和培養條件與1．2相同。

表2 金線蓮不定芽生根培養的配方設計Table 2 Component design of A．roxburghii adventitious buds rooting

1．4煉苗移栽

金線蓮移栽基質要求疏松、透氣、排水性能良好。選擇以下3種基質進行試驗：1）珍珠巖∶泥炭土∶松樹皮＝1∶1∶1；2）珍珠巖∶泥炭土＝1∶1；3）泥炭土∶松樹皮＝1∶1。具體操作為待生根后的組培苗生長到3～5cm，有2～5片葉時，將培養瓶移到室外打開瓶蓋練苗3～5d，然后洗去小苗基部的殘留培養基，移入預先消毒過的珍珠巖、泥炭土、松樹皮的3種基質中，每天葉片噴霧1次，保持環境相對濕度在80%～90%，并加強栽培管理，經過4周的生長培養后，觀察其生長情況。

2結果與分析

2．1不同濃度激素配比金線蓮的不定芽增殖

接種1周后，1號、4號、5號、6號、7號培養基開始出現萌動的現象，莖節開始膨大，腋芽發白，生長狀況良好；3號、8號、9號培養基萌動現象不明顯。接種15～20d后，4號、6號、7號、9號培養基增殖效果明顯，植株周圍產生少量肉眼可見的突起，腋芽開始分化可觀察到乳白色的不定芽，少數莖段表面形成白色絨毛；30d后，可見明顯的叢生芽，芽體嫩綠；35d后，叢生芽繼續生長，但不繼續產生新的不定芽。

由表3可知：不同激素濃度配比對金線蓮叢生芽增殖的影響差異顯著。在選擇的3個因子中，隨6－BA濃度的上升，增殖后不定芽總數逐漸增加，且3個水平差異顯著；隨NAA濃度的上升，不定芽總數呈先下降后上升的趨勢；隨蔗糖濃度的上升，不定芽總數反而呈下降趨勢，且3個水平差異較大。

不同試驗因子對不定芽繼代培養增殖倍數影響的極差R（表4）順序：NAA＞6－BA＞蔗糖。適量濃度的NAA有利于不定芽萌發增殖，并有利于芽體萌發后的生長健壯，以0．5mg／L最佳。從試驗結果綜合考慮，配方6（MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L）對金線蓮不定芽增殖效果較佳，此時芽增殖倍數最高，達7．08，且表現為葉緣光滑，葉表面為黑紫色，金色葉脈明顯，苗高莖粗，長勢較好。

表3 不同激素配比處理金線蓮的不定芽增殖情況Table 3 Proliferation of A．roxburghii adventitious buds in different hormone proportion

表4 不同激素配比處理金線蓮不定芽增殖的極差Table 4 Range of A．roxburghii adventitious buds in different hormone proportion

2．2不同濃度激素金線蓮試管苗的生根

金線蓮根的生長比較緩慢，培養12～20d開始萌發生長。由表5可知，1號、2號、3號培養基的生根效果不理想，生根率低，根的質量比較細弱，平均根長較短。通過分析可知，單一的生長素對根的誘導培養效果不顯著。從生根率、平均生根數、平均根長方面綜合考慮，5號培養基（1／2MS＋IBA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L）處理的生根效果最好，生根率達96%，平均生根數為2．89條。說明，NAA與IBA的配合使用有利于金線蓮不定芽生根。

表5 不同濃度激素處理金線蓮不定芽的生根Table 5 Rooting of A．roxburghii adventitious buds in different concentrations hormone

2．3煉苗移栽

從表6可知，在珍珠巖∶泥炭土∶松樹皮＝1∶1∶1混配的基質中移栽成活率最高，達98%，生長狀況最好，植株質量粗壯，葉正常舒展。珍珠巖密質適中，疏松透氣，不易板結，排水能力良好，樹皮經發酵處理，不易長菌，且保水保肥，可能是其移栽成活率高、長勢好的原因。而在其他2種基質中金線蓮移栽的成活率則較低，2號基質的成活率為76%，3號基質的成活率為88%，植株生長較緩慢，植株瘦小，葉微卷曲。

表6 不同基質金線蓮組培苗移栽的成活率Table 6 Transplanting survival rate of A．roxburghii seedlings in different matrix

3結論與討論

影響金線蓮試管苗生長發育的因素比較多。如基本培養基、激素成分及含量、pH、光照、溫度等。其中，激素的種類、含量及比例是最關鍵的因素。如MS＋6－BA 3．5mg／L＋KT 1．5mg／L＋NAA 0．6 mg／L組合是芽快速增殖的最佳配方，3種激素對芽繼代增殖系數影響大小為6－BA＞NAA＞KT［8－11］。何碧珠［9］通過試驗得出：1／2MS＋BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋KT 1．0mg／L＋香蕉汁100g／L＋AC 0．2%配方為金線蓮芽增殖的最適激素組合。分析認為，香蕉汁中含有大量的糖類和植物激素，如生長素、細胞分裂素、乙烯和赤霉素，可為植物組織細胞分裂分化提供能量。研究采用正交試驗設計方案優化的最佳增殖配方為MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L，試管苗長勢健壯，葉片伸展。

IBA和NAA在一定的濃度配比下能促進植物的快速生長，促使莖的伸長，促進植物生根和有效減緩根的老化［12］。適宜濃度的NAA與IBA的激素配比對金線蓮根的誘導效果較好。陳兆貴［10］認為，在生根培養過程中加入一定量的活性炭和水解酪蛋白有利于提高生根率。本試驗結果表明，1／2MS＋IBA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L效果最理想，生根率最高，根的質量最好。

25%粗松樹皮＋75%進口泥炭土為臺灣金線蓮生長的最優栽培基質［13］。本試驗在此基礎上加入珍珠巖，且三者之間的比例為1∶1∶1時可使成活率達98%，且幼苗長勢旺盛。分析認為，珍珠巖有疏松透氣、不易使土壤板結的功效，有利于金線蓮幼苗根的透氣生長。同時本研究表明，在移栽過程中要注意基質和幼苗本身的消毒，金線蓮移栽前期階段，影響其成活率的重要因素是保證充足的水分。移栽的試管苗根較少，葉片較多時容易發生萎焉，分析可能與其蒸騰作用有關［14］。

［1］魏翠華，謝 宇，陳 沁，等．臺灣金線蓮增殖培養正交試驗設計［J］．亞熱帶植物科學，2012，41（4）：57－59．

［2］黃小鳳，周志東，楊 成，等．珍稀藥用植物金線蓮及其栽培技術［J］．廣東農業科學，2005（5）：80－81．

［3］羅安雄，孟志霞，陳曉梅，等．福建金線蓮種子萌發及幼苗培養研究［J］．中國藥學雜志，2012（15）：11－13．

［4］高 燕，白燕冰，趙云翔．金線蓮組織培養幾種培養基的篩選［J］．熱帶農業科技，2004，27（3）：12－14．

［5］魏翠華，秦建彬，謝 宇，等．應用正交設計法優選臺灣金線蓮快繁培養基［J］．中國農學通報，2013，29（4）：114－117．

［6］李艷冬，葉紅霞，陳麗萍．金線連組培快繁技術體系的研究［J］．江西農業學報，2013，25（4）：52－54．

［7］李丹丹，張付遠．金線蓮莖尖的組培快繁技術研究［J］．中國科技信息，2011，21（2）：19．

［8］王雅英，林榮耀，楊忠耿，等．金線蓮快速繁殖及促根壯苗試驗［J］．亞熱帶植物科學，2005，34（3）：40－42．

［9］何碧珠，何官榕，黃銘星，等．福建野生金線蓮快速繁育技術［J］．農業工程，2013，3（2）：72－76．

［10］陳兆貴．金線蓮組織培養和移栽技術研究［J］．惠州學院學報，2007，27（6）：14－17．

［11］周玉美，陳 麗，崔永一，等．臺灣金線蓮（Anoectochilus formosanus）快繁體系的構建［J］．東北林業大學學報，2009，37（12）：43－47．

［12］岑秀芬，韋鵬霄，劉 芳．植物生長調節劑對臺灣金線蓮試管苗增殖和生根的影響［J］．廣西農學報，2009，24（2）：19－21．

［13］謝 靜，譚嘉娜，楊俊賢，等．不同栽培基質對金線蓮生長和生物產量的影響［J］．廣東農業科學，2014 （20）：33－36．

［14］馬以忠，鄧琳瓊，黃麗華．金線蓮的研究現狀及展望［J］．貴州科學，2006，25（2）：81－84．

（責任編輯：劉忠麗）

Optimization of Tissue Culture and Rapid Propagation of Anoectochilus roxburghii

XIAO Xiaojun1，WANG Manding2，ZENG Zhenjia1，TANG Zhengyi1＊
（1．School of Life Science，Neijiang Normal University，Neijiang，Sichuan641100；2．Guanghua Campus of Chengdu Shude High School，Chengdu，Sichuan610031，China）

To optimize the technical architecture of rapid propagation of A．roxburghii，the effects on proliferation and rooting of adventitious buds were studied by adding different concentrations of plant hormones（6－BA，NAA，IBA），sucrose and charcoal，while using the aseptic seedlings as explants and MS as the basic medium，then the experiment of transplanting was conducted．The results showed that the optimum culture medium for adventitious buds proliferation was MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋sucrose 40g／L，while 1／2MS＋IBA0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋AC 0．2g／L was better for rooting．The optimum transplanting matrix was perlite∶peat∶bark＝1∶1∶1，and the survival rate was 98%．

Anoectochilus roxburghii；tissue culture；rapid propagation

S688．2

A

1001－3601（2016）02－0053－0012－03

2015－09－09；2016－01－07修回

四川省教育廳科研創新團隊“川西珍稀植物資源保護與利用”（14TD0025）

肖小君（1982－），女，碩士，助理研究員，從事經濟植物組織培養研究工作。E－mail：qianqianxxj＠126．com

＊通訊作者：唐正義（1957－），男，教授，從事遺傳毒理的研究。E－mail：tangzy9513＠163．com