鬼針草葉蛋白最佳提取時期與方法的篩選

謝先中，陳曉武，王永樹

（1．貴州省黔西南民族職業技術學院生物工程系，貴州興義562400；2．上海海洋大學水產與生命學院，上海201306）

鬼針草葉蛋白最佳提取時期與方法的篩選

謝先中1，陳曉武2，王永樹1

（1．貴州省黔西南民族職業技術學院生物工程系，貴州興義562400；2．上海海洋大學水產與生命學院，上海201306）

為了找到鬼針草葉蛋白提取最佳生長期和有效提取方法，研究了鬼針草不同生育期和不同方法對葉蛋白提取的影響。結果表明：在鬼針草4個不同生育期中采用直接加熱法提取，葉蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量依次降低，營養生長期（20．2mg／g，61．36%）＞現蕾期（15．9mg／g，61．25%）＞盛花期（14．7mg／g，60．97%）＞結果期（12．1mg／g，54．22%），均以營養生長期為最高。在鬼針草的營養生長期，采用多種方法提取葉蛋白，葉蛋白提取率：酸化加熱＋聚乙二醇沉淀法（29．4mg／g）＞酸化加熱＋乙醇沉淀法（27．9mg／g）＞酸化加熱＋氯化鈉法（24．7mg／g）＞酸化加熱法（23．1mg／g）＞直接加熱法（20．2mg／g）；沉淀物中粗蛋白含量：酸化加熱＋乙醇沉淀法（65．35%）＞酸化加熱＋氯化鈉法（60．72%）＞酸化加熱＋聚乙二醇沉淀法（57．13%）。

鬼針草；葉蛋白；不同生育期；不同提取方法；提取率；粗蛋白

鬼針草（Bidens bipinnata L．），又名婆婆針，為菊科鬼針草屬一年生草本植物。鬼針草種子多，自播力強，莖倒伏后可生根，早期生長快，對環境的要求極低，產量極高，在全國各地均有分布，已成為侵占力極強的害草之一［1－2］。但研究表明，鬼針草營養豐富、蛋白質、微量元素和維生素的含量高［3－5］；同時鬼針草具有多種藥用功效，如清熱、解毒、止瀉散瘀、消腫，可以用于治瘧疾、肝炎、胃病等［6－8］。因此，是一種極具開發潛力的動物飼草資源。然而鬼針草含有苦味質，養殖動物不喜食，使得這一廉價飼料資源未能得到充分利用。鬼針草干物質中粗蛋白含量高達18．9%［5］，若提取其中葉蛋白，將苦味質去除作為飼料添加，將是一條提高鬼針草飼草資源利用的有效途徑。當前用于生產濃縮葉蛋白的主要原料有苜蓿、甘薯、莧菜、聚合草、紫云英等［9－14］，而對鬼針草葉蛋白的提取應用的研究尚未見報道。為找到鬼針草葉蛋白提取最佳生長期和有效提取方法，筆者研究鬼針草不同生育期與方法對葉蛋白提取的影響，旨在為鬼針草葉蛋白飼料的開發生產提供參考。

1材料與方法

1．1試驗材料

1．1．1植物材料 鬼針草鮮樣刈割于在貴州省黔西南民族職業技術學院校園附近草地，為自然形成的單一鬼針草叢，收獲地上莖葉。

1．1．2試劑與儀器 試驗試劑有氯化鈉、聚乙二醇、無水丙酮、無水乙醇、鹽酸，試驗儀器有CP64電子分析天平（上海洪紀儀器設備有限公司）、恒溫水浴鍋、組織搗碎機（上海汗諾儀器有限公司）、Starter 3C酸度計（上海洪紀儀器設備有限公司）、烘箱。

1．2植物液制備

鬼針草鮮樣剪碎成0．5～1．0cm的小段，混合均勻，電子分析天平稱取鮮樣100g左右，按原料∶水＝1∶1質量比加入蒸餾水，粉碎打漿3min （10 000r／min），用醫用紗布兩層疊放在一起壓濾，充分擠壓，擠出綠色汁液，分別置于錐形瓶中。用蒸餾水將草渣洗滌2次，與第1次壓濾汁液混合，蒸餾水每份定容至300mL（料液體積比為1∶3），用膠塞塞住瓶口（防止葉蛋白酶解），備用。

1．3不同生育期鮮草葉蛋白的提取

分別在鬼針草的營養生長期、現蕾期、盛花期、結果期采集樣品，按上述制備成汁液。采用直接加熱法提取，取100mL鬼針草汁液，70℃水浴加熱5min。靜置30min，出現沉淀，過濾，在65℃干燥稱重，重復3次。

1．4不同方法提取葉蛋白

在鬼針草的營養生長期采集樣品，按上述制備成汁液。

取100mL鬼針草汁液，直接70℃水浴加熱5min。靜置30min，出現沉淀，過濾，在65℃干燥稱重，3次重復。

取100mL鬼針草汁液，用1mol／L的鹽酸調節汁液pH為4．0，70℃水浴加熱5min。靜置30min，出現沉淀，過濾，在65℃干燥稱重，3次重復。

取100mL鬼針草汁液，用1mol／L的鹽酸調節汁液pH為4．0，70℃水浴加熱5min。參考相關葉蛋白提取資料［15－18］，分別加入0．3g氯化鈉、50mL無水乙醇、0．1g聚乙二醇，靜置30min，出現沉淀，過濾，在65℃干燥稱重，3次重復。

1．5鬼針草葉蛋白提取率的計算

葉蛋白產量為沉淀干燥后質量乘以3倍，3次重復取均值。提取率按以下公式計算：

葉蛋白提取率＝m沉淀物／m鬼針草鮮樣

葉蛋白提取物中的粗蛋白含量使用凱氏定氮法測定。數據用SPSS（Ver．11．5）軟件Duncan多重比較檢驗各組間的差異，P＜0．05表示差異顯著。所有的結果均以平均值±標準誤（X±SE）表示。

2結果與分析

2．1不同生育期對鬼針草葉蛋白提取率的影響

由表1可見，在營養生長期、現蕾期、盛花期、結果期4個生育期，葉蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量依次降低，營養生長期（20．2mg／g，61．36%）＞現蕾期（15．9mg／g，61．25%）＞盛花期（14．7mg／g，60．97%）＞結果期（12．1mg／g，54．22%）。葉蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量均以營養生長期為最高（圖示）。結果期葉蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量顯著下降（P＜0．05），與營養生長期相比較分別下降40．09%和11．64%。

表1 不同生育期提取鬼針草的葉蛋白Table 1 Extraction rate of leaf protein fromB．bipinnata

圖示 不同生育期的鬼針草葉蛋白提取率Fig． Variation regularity of leaf protein extraction from Bidens bipinnata at different growth stage

2．2不同方法對鬼針草葉蛋白提率的影響

從表2可見，葉蛋白提取率，酸化加熱＋聚乙二醇沉淀法（29．4mg／g）＞酸化加熱＋乙醇沉淀法（27．9mg／g）＞ 酸化加熱 ＋ 氯化鈉法（24．7mg／g）＞酸化加熱法（23．1mg／g）＞直接加熱法（20．2mg／g）。氯化鈉、乙醇、聚乙二醇3種沉淀劑均可以提高葉蛋白提取率，酸化加熱＋聚乙二醇沉淀法葉蛋白提取率最高，與直接加熱相比較提高45．5%，差異極顯著（P＜0．01）。而從沉淀物中粗蛋白含量看，酸化加熱＋乙醇沉淀法（65．35%）＞酸化加熱＋氯化鈉法（60．72%）＞酸化加熱＋聚乙二醇沉淀法（57．13%）。用乙醇提取沉淀物中粗蛋白含量最高，與直接加熱法比較提高6．83% （P＜0．05）。而用聚乙二醇沉淀，雖然提取率提高，但沉淀物中粗蛋白含量卻明顯降低，與直接加熱法比較下降6．60%（P＜0．05）、乙醇沉淀法相比比較下降12．58%（P＜0．05）。

表2 不同方法提取的鬼針草葉蛋白Table 2 Extraction rate of leaf protein fromB．bipinnata with different extraction methods

3結論與討論

3．1鬼針草葉蛋白提取的最佳生育期

隨著植物的生育期變化，植物組織中物質的組成和含量不斷變化。豆科類牧草蛋白質含量一般以盛花期為最高［19］，而本試驗中葉蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量均以營養生長期為最高。在現蕾期前，鬼針草物質代謝旺盛，組織幼嫩多汁，蛋白質總含量較高，而現蕾期后，植株趨于老熟，木質素和纖維素含量增加，蛋白質的分離和沉淀更加困難，導致葉蛋白提取率和沉淀中粗蛋白含量均降低，因此營養生長期是鬼針草葉蛋白提取的最佳時期，但營養生長期未能達到鮮草的最大生產量，也可考慮在結果期之前進行提取。

3．2鬼針草葉蛋白提取的最佳方法

沉淀劑的加入是提高葉蛋白提取率的關鍵，氯化鈉、乙醇和聚乙二醇均可有效提高葉蛋白提取率［1518］。聚乙二醇的沉淀作用最好，但沉淀物中粗蛋白含量卻明顯降低。用乙醇沉淀可以同時提高葉蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量，但乙醇所用比例較大，本試驗乙醇比例為50%，只適合小劑量提取。因此，若對沉淀物粗蛋白含量要求不高，如用于動物飼料添加（其他成分也可利用），可考慮采用聚乙二醇沉淀；如果用于食品添加、醫療等，對沉淀物粗蛋白含量要求高，可考慮采用氯化鈉鹽析。同時應結合酸化加熱以提高葉蛋白提取率。

3．3鬼針草葉蛋白提取條件的優化

本試驗研究了鬼針草不同生育期和不同方法對葉蛋白提取的影響，但葉蛋白提取中料水比，提取溫度，pH也是影響草葉蛋白提取率，沉淀物中粗蛋白含量的重要因素。其次，本試驗中沉淀劑的加入采用參考量。因此有必要對以上條件進行優化，進一步提高鬼針草葉蛋白的提取效果，以促進鬼針草葉蛋白的工業化生產。

［1］田興山，岳茂峰．外來入侵雜草白花鬼針草的特征特性［J］．江蘇農業科學，2010（5）：174－175．

［2］郝建華，劉倩倩，強 勝．菊科入侵植物三葉鬼針草的繁殖特征及其與入侵性的關系［J］．植物學報，2009 （6）：656－665．

［3］張延昌．鬼針草的研究現狀與應用前景［J］．山東教育學院學報，2004（4）：79－83．

［4］李 昉．野生植物鬼針草營養成分的研究［J］．山東化工，2007（3）：37－38．

［5］陳春剛，韓芬霞．鬼針草中主要成分指標的測定［J］．農產品加工：學刊（下），2009（4）：28－30．

［6］吳婷妮，余長柱，李 榮，等．鬼針草的研究進展［J］．安徽醫藥，2014（9）：1614－1616．

［7］孔維忠，熊永輝．鬼針草屬植物化學成分及其藥理作用的研究［J］．醫學信息，2011（3）：1239－1241．

［8］陳 川．鬼針草的臨床應用［J］．臨床合理用藥雜志，2013（6）：28．

［9］尹 衛，田海寧．“青大1號”紫花苜蓿葉蛋白提取條件優化［J］．草業與畜牧，2013（6）：6－10．

［10］王世寬，于海光，許艷麗．乳酸發酵酸法提取甘薯葉蛋白研究［J］．安徽農業科學，2010（12）：6517－6518．

［11］林燕如，張曉芝．莧菜葉蛋白提取工藝研究［J］．北方園藝，2013（18）：139－142．

［12］李鳳玲，何金環．聚合草鮮草葉蛋白提取條件研究［J］．中國草地學報，2009，31（2）：76－80．

［13］賀筱蓉，李永泉，趙小立，等．紫云英葉蛋白提取工藝研究［J］．天然產物研究與開發，1994，6（4）：98－102．

［14］唐世敏，姜東燕．不同處理對苜蓿葉蛋白提取的影響［J］．安徽農業科學，2012，40（36）：17624－17625．

［15］熊春梅，陳粉粉．幾種處理對三葉草葉蛋白提取率及蛋白質質量分數的影響［J］．畜禽業，2012（3）：8－10．

［16］曲 敏，馬永強．不同方法提取苜蓿葉蛋白效果的比較及表征［J］．食品科學，2012，33（14）：91－95．

［17］董雙濤，李寶霞．聚合草葉蛋白的酸化加熱法提取工藝研究［J］．山西中醫學院學報，2012，13（2）：45－47．

［18］王康英．藜葉蛋白質提取方法比較試驗［J］．中國畜牧獸醫文摘，2011，27（5）：178－179．

［19］田玉民，何麗濤．刈割期對紫花苜蓿葉粉營養成分的影響［J］．草業科學，2007，24（1）：38－40．

（責任編輯：劉忠麗）

生理生化·耕作栽培

Physiology and Biochemistry·Tillage and Cultivation

Period and Method of Leaf Protein Extraction from Bidens bipinnata

XIE Xianzhong1，CHEN Xiaowu2，WANG Yongshu1
（1．Department of Biological Engineering，Southweast Guizhou Vocational College of Technology for Nationalities，Xingyi，Guizhou 562400；2．College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The effect of different B．bipinnata growth stage and different extraction methods on leaf protein extraction rate fromB．bipinnata was studied to probe the optimum growth stage of B．bipinnata for extracting its leaf protein and effective extraction method．Results：The leaf protein rate and crude protein content in the sediment at vegetative，budding，full flowering and fruit－bearing stage are 20．2mg／g and 61．36%，15．9mg／g and 61．25，14．7mg／g and 60．97%，and 12．1mg／g and 54．22% respectively by using the direct heating method．When B．bipinnatais at the vegetative stage，the leaf protein extraction rate of the acidification heating＋polyethylene glycol，acidification heating＋ethanol，acidification heating＋NaCl，acidification heating and direct heating method is 29．4mg／g，27．9mg／g，24．7mg／g，23．1mg／g and 20．2mg／g respectively but the crude protein content in the sediment of acidification heating＋ethanol，acidification heating＋NaCl and acidification heating＋polyethylene glycol method is 65．35%，60．72%and 57．13%respectively．

Bidens bipinnata；leaf protein；growth period；extraction method；extraction rate；crude protein

S831．5；Q949．95

A

1001－3601（2016）02－0056－0024－03

2015－07－21；2016－01－13修回

黔西南民族職業技術學院科研資助項目“鬼針草野生飼草資源的綜合開發與利用”（201507）

謝先中（1980－），男，講師，碩士，從事動物營養與疾病防治研究。E－mail：xiexianzhong2008＠163．com