節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

肖 敏，曾向萍，嚴婉榮，陳綿才，趙志祥＊，芮 凱

（1．海南省農業科學院植物保護研究所，海南海口571100；2．海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海南海口571100）

節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

肖 敏1，2，曾向萍1，2，嚴婉榮1，2，陳綿才1，2，趙志祥1，2＊，芮 凱1，2

（1．海南省農業科學院植物保護研究所，海南海口571100；2．海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海南海口571100）

為了對海南瓜類蔬菜炭疽病菌的抗性監測研究及抗性治理提供理論依據，對海南不同市縣采集的節瓜炭疽病病樣中分離純化的90株炭疽病原菌進行了檢測，采用菌絲生長速率法測定2種病原菌對嘧菌酯的敏感性。結果表明：經分生孢子形態鑒定節瓜炭疽病有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．acutatum），膠孢炭疽菌為優勢種群，占84．4%；2種病原菌對嘧菌酯的EC50在0．334 4～36．467 0μg／mL，平均為12．954 4μg／mL，敏感性分布接近于正態分布，EC50值之間表現較連續，故以平均EC50值為敏感性基線，用于節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的田間抗藥性監測。嘧菌酯與多菌靈、福美雙、丙環唑和咪鮮胺不存在交互抗性。

節瓜；炭疽病菌；嘧菌酯；敏感性；交互抗性

節瓜屬葫蘆科一年生攀援草本植物，是冬瓜的一個變種，形體從短圓柱形到長圓柱形，原產我國南部，是我國的特種蔬菜之一，在廣東、廣西、臺灣已有多年栽培歷史。節瓜具有清熱、清暑、解毒、利尿、消腫等功效，是炎熱夏季的理想蔬菜，其含鈉和脂肪都低，常吃可起到減肥的作用。炭疽病（Anthracnose）是葫蘆科瓜類蔬菜生產上的重要病害之一，也是節瓜的重要病害，種植地常發生。發病時常造成幼苗猝倒，成株莖、葉枯死及瓜果腐爛，有時癥狀會混合發生，危害嚴重。

生產中炭疽病主要以化學防治為主，常用的藥劑有福美雙、百菌清、多菌靈、苯菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺和苯醚甲環唑等［1－2］，而在海南常使用嘧菌酯作為防治藥劑。嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是一類能有效控制子囊菌、擔子菌、半知菌和卵菌危害的廣譜性殺菌劑［3］。與苯并咪唑類、苯酰胺類、二甲亞胺類及DMI類殺菌劑無交互抗藥性，在全世界被普遍使用。由于嘧菌酯作用位點單一，并且作用的靶標自發突變的頻率較高，在高選擇壓力下，病原菌很容易產生抗藥性的群體［4］。國內對西瓜、黃瓜、辣椒、芒果、柑橘炭疽病的研究多側重于病害的發生識別、規律、藥劑的室內毒力測定及化學藥劑的防治方面［5－9］。黃樹生等［10］通過田間試驗比較啶氧菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲環唑、苯甲嘧菌酯5種藥劑對西瓜炭疽病的控制效果，唐爽爽等［11］和胡育海等［12］進行了幾種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的毒力測定或配比試驗，張令宏等［13］研究23種殺菌劑對8株抗多菌靈的芒果炭疽病菌的室內毒力及其交互抗性，楊葉等［14］對海南23株芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性進行了測定，詹儒林等［15］研究了來自廣東和海南的芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性，但相關研究中節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性及相關性研究未見報道。因此，筆者通過生長速率法研究了海南節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性基線及其4種不同類型常用殺菌劑的交互抗性，為海南瓜類蔬菜炭疽病菌的抗性監測研究及抗性治理提供理論依據。

1材料與方法

1．1試驗材料

藥劑：95%嘧菌酯原藥，98．4%多菌靈原藥，96%福美雙原藥，97．8%丙環唑原藥，96%咪鮮胺原藥，以上5種原藥均由中國農業科學院植物保護研究所提供。

試驗用化學試劑：99%水楊肟酸、甲醇、丙酮、鹽酸均為市售品。

PDA培養基：土豆200g，葡萄糖20g、瓊脂粉20g，蒸餾水1 000mL，pH自然。

1．2病害樣本采集、分離和鑒定

2013年從海南省海口、澄邁、定安、臨高4市縣節瓜種植地采集未施用過嘧菌酯的炭疽病病樣，經過常規組織分離［16］、純化、鑒定，并將純化的菌株保存于4℃冰箱中備用。

1．3炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性測定

嘧菌酯濃度設為0、0．01μg／mL、0．1μg／mL、1μg／mL、10μg／mL和100μg／mL，先用甲醇溶解嘧菌酯原藥，配制成1×104μg／mL的貯液待用，然后再配成所需濃度的平板，99%水楊肟酸溶于甲醇，配制成100μg／mL濃度的平板，以加水楊肟酸不加藥為對照，每個處理3次重復。將待測的菌株在PDA培養基平板上培養5d，用無菌打孔器從菌落邊緣打取直徑5mm的菌塊，用接種針挑取菌塊，菌絲面朝下接種在培養基平板中央，培養皿直徑90mm，每皿接1個菌塊，每處理3皿。28℃培養7d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。計算生長抑制率，采用機率值分析法計算藥劑對靶標菌菌絲的有效抑制濃度，根據抑制率計算其EC50值。

抑制率＝［1－（處理菌落直徑－5）／（對照菌落生長直徑－5）］×100%［17］

1．4嘧菌酯與不同殺菌劑的交互抗藥性測定

用嘧菌酯的4個相對敏感和4個相對抗性的菌株，采用菌絲生長速率法，分別測定其對多菌靈、丙環唑、咪鮮胺和福美雙的敏感性。

1．5數據的統計分析

采用SPSS統計分析軟件，求出毒力回歸方程y＝bx＋a及其各藥劑的EC50（μg／mL）和相關系數，然后進行鄧肯氏差異性顯著分析。

2結果與分析

2．1病原種群類型

共分離純化獲得90株炭疽菌，經分生孢子形態鑒定，有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．acutatum）2種（圖1），其中膠孢炭疽菌有76株，尖孢炭疽有14株，以膠孢炭疽為主，數量是總菌株的84．4%，為優勢種群（表）。

圖1 2種炭疽菌菌株的分生孢子形態Fig．1 Conidium morphology of two C．orbiculare strains

表 海南節瓜炭疽病菌種類Table Types of C．orbicularein zucchini in Hainan

2．2節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性

對90株炭疽菌進行敏感性測定，其EC50最大、最小和平均值分別為0．334 4μg／mL、36．467 0μg／mL和12．954 4μg／mL，標準差為8．027 4，最大值是最小值的109．05倍。在SPSS19．0統計軟件中對EC50值進行單樣本K－S正態性分布檢驗，得Kolmogorov－Smimov Z＝1．133，漸進連續性P＝0．153＞0．05，檢驗分布為正態分布，EC50值表現連續性。因此，平均EC50值（12．954 4±8．027 4）μg／mL，可作為節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性基線（圖2），用于節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的田間抗藥性監測。

2．3嘧菌酯與不同殺菌劑間的交互抗性

從圖3敏感性的相關結果可見，嘧菌酯與多菌靈、丙環唑、咪鮮胺和福美雙4試驗藥劑的相關系數分別為0．341 9、0．023 6、0．501 1和0．027 7。對其EC50值進行線性回歸分析得出，嘧菌酯與上述4種藥劑無顯著相關性，說明嘧菌酯與這4種藥劑之間不存在交互抗性。

圖2 節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性頻率分布Fig．2 Frequency distribution of sensitivity of C．orbiculare to Azoxystrobin

圖3 嘧菌酯與不同類型殺菌劑的交互抗性Fig．3 Cross－resistance between Azoxystrobin and other four fungicides

3結論與討論

1）節瓜上采集到的炭疽病菌有膠孢炭疽和尖孢炭疽兩種，膠孢炭疽菌為優勢種群。未分離到瓜類炭疽菌，而王會芳等［18］報道，2010年在海南苦瓜上分離鑒定到瓜類炭疽菌［Colletotrichum oribiculared（Berk．Mont）Arx］，這可能與采集的樣本有關，而是否還有其他的病原菌種類，還有待于進一步監測。

2）李紅霞等［4］在江蘇海南采集到45株辣椒炭疽菌和膠孢炭疽菌，采用孢子萌發法測定2種菌對嘧菌酯的敏感性為（0．047±0．040）μg／mL，同時認為采用孢子萌發法比菌落直徑法測定辣椒炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性更為科學，而本研究采用生長速率法測定采集到的2種炭疽菌對嘧菌酯的敏感性較高，這可能與采集地區、作物品種、使用方法、病原菌種類及當地用藥歷史不同有關，而對于節瓜炭疽病菌來說，哪種方法更為科學簡便，還有待于研究。

3）海南種植節瓜面積逐年增大，發病率一般為10%～30%，嚴重時達70%～80%，輕則造成減產，影響品質，重則造成巨大損失。多菌靈、丙環唑、咪鮮胺和福美雙是與嘧菌酯不同類型的殺菌劑，分屬苯并咪唑類、三唑類、咪唑類和二硫代氨基酸鹽類，不同殺菌劑作用方式、作用位點等的不同，抗藥性也不盡相同。本研究通過試驗明確了嘧菌酯與多菌靈、丙環唑、咪鮮胺和福美雙之間無交互抗性。為了延緩該殺菌劑抗性的產生，可根據生產上病害發生情況采用不同作用機制的藥劑輪換使用。生產上高效、內吸、選擇性強的殺菌劑被廣泛的應用，其抗藥性越來越普遍和嚴重，使得化學防治失敗，生產遭受重大損失。筆者通過測定海南地區節瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性，建立敏感性基線，通過早期監測，提出科學的用藥方法，為抗性治理提供科學依據。

［1］呂佩珂，李明遠，吳鉅文，等．中國蔬菜病蟲原色圖譜［M］．北京：農業出版社，1992：14－15．

［2］于 洋，李寶聚，陳 雪，等．瓜類及茄果類炭疽病的識別與防治［J］．中國蔬菜，2006（12）：49－50．

［3］祁之秋，王建新，陳長軍，等．現代殺菌劑抗性研究進展［J］．農藥，2006，45（10）：655－659．

［4］李紅霞，劉照云，王建新，等．辣椒炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性測定［J］．植物病理學報，2005，35（1）：73－77．

［5］張存松，霍治邦，劉 宏，等．瓜類炭疽病的發生規律與防治方法［J］．西北園藝，2004（5）：43．

［6］許 筱，施 艷，高書鋒，等．拮抗乳酸菌的篩選及其對黃瓜炭疽菌的防治效果［J］．河南農業科學，2012，41（5）：87－91．

［7］周傳波，謝圣華，吉訓聰，等．海南省辣椒炭疽病病原鑒定與防治試驗［J］．現代農業科技，2008（1）：63－64．

［8］黃忠興，安玉興，黃錦福，等．海南芒果炭疽病的發生規律與綜合防治［J］．熱帶農業科技，2008，31（2）：21－23．

［9］周小燕，姜于蘭．不同殺菌劑對柑橘炭疽菌的田間防治效果［J］．湖北農業科學，2011，50（15）：3080－3082．

［10］黃樹生，盧行尚．5種藥劑對西瓜炭疽病的田間防治效果研究［J］．農業科學與管理，2013，34（10）：55－57，28．

［11］唐爽爽，劉志恒，余朝閣，等．9種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的室內毒力測定及配比試驗［J］．植物保護，2014，40（6）：171－175．

［12］胡育海，嚴秀琴，顧振芳，等．六種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的毒力測定［J］．上海交通大學學報：農業科學版，2007，25（4）：402－404．

［13］張令宏，李 敏，高兆銀，等．抗多菌靈的芒果炭疽病菌的殺菌劑篩選及其交互抗性測定［J］．熱帶作物學報，2009，30（3）：347－352．

［14］楊 葉，何書海，張淑娟，等．海南芒果炭疽菌對多菌靈的抗藥性測定［J］．熱帶作物學報，2008，29（1）：73－77．

［15］詹儒林，李 偉，鄭服叢．芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性［J］．植物保護學報，2005，32（1）：71－76．

［16］方中達．植病研究方法［M］．北京：中國農業出版社，1998：122－124．

［17］林才華，王開運，顧春波，等．山東省草莓枯萎病菌對四種三唑類殺菌劑的敏感性檢測［J］．植物保護學報，2009，36（1）：55－60．

［18］王會芳，曾向萍，芮 凱，等．苦瓜炭疽病病原鑒定及生物學特性初步研究［J］．中國農學通報，2011，28 （7）：141－145．

（責任編輯：聶克艷）

Sensitivity of Colletotrichum orbiculareIsolated from Zucchini to Azoxystrobin and Cross－Resistance between Azoxystrobin and Other fungicides

X
IAO Min1，2，ZENG Xiangping1，2，YAN Wanrong1，2，CHEN Miacai1，2，ZHAO Zhixiang1，2＊，RUI Kai1，2
（1．Institute of Plant Protection，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou，Hainan571100；2．Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests，Haikou，Hainan571100，China）

The sensitivity of 90 C．orbiculare strains isolated and purified from zucchini samples infected with C．gloeosporioides and C．acutatumcollected from different cities（counties）in Hainan to Azoxystrobin by mycelial growth rate to provide the theoretical basis for resistance monitoring and management of melon vegetables against C．orbicularein Hainan．Results：There are C．gloeosporioides and C．acutatumin anthracnose of zucchini according to identification of conidium morphology．C．gloeosporioides is a dominant species and accounts for 84．4%．EC50of C．gloeosporioides and C．acutatum is 0．334 4～36．467 0μg／mL and their average EC50is 12．954 4μg／mL．The average EC50value is used as the sensitivity baseline because the sensitivity distribution is close to Gaussian distribution，which can be used to monitor resistance of C．orbiculare to Azoxystrobin in zucchini field．There is no cross－resistance between Azoxystrobin and Carbendazim，Thiram，Propiconazoie，Prochioraz respectively．

zucchini；Colletotrichum orbiculare；Azoxystrobin；sensitivity；cross－resistance

S436．429

A

1001－3601（2016）02－0071－0085－04

2015－05－02；2016－02－04修回

公益性行業（農業）科研專項“農作物重要病原菌抗藥性監測及治理技術研究與示范”（201303023）；“十二五”國家科技支撐計劃“熱帶蔬菜主要病蟲害防控技術研究與集成示范”（2012BAD19B06－07）；海南省省屬科研院所技術開發研究專項“北運瓜菜重大病蟲害抗藥性治理與農藥殘留控制技術研究”（KYYS－2015－01）

肖 敏（1970－），女，副研究員，從事植物病理學和病害綜合防控技術研究。E－mail：xiaominnky＠21cn．com

＊通訊作者：趙志祥（1981－），男，副研究員，博士，從事植物病理學和微生物學研究。E－mail：zhaozhixiang0207＠126．com