細黃鏈霉菌對黃芩抗根腐病的誘導反應

李堆淑

（商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛726000）

細黃鏈霉菌對黃芩抗根腐病的誘導反應

李堆淑

（商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛726000）

為研究細黃鏈霉菌誘導黃芩對黃芩根腐病菌的抑制效果，采用不同濃度細黃鏈霉菌發酵液、無菌水（CK）分別浸泡黃芩幼苗的根8h，幼苗移栽后在黃芩幼苗根部接種5mL黃芩根腐病菌菌懸液，待幼苗生長至4葉期時，不同時間內測定黃芩葉片的CAT、POD和AAO活性。結果表明，不同濃度細黃鏈霉菌發酵液對黃芩葉片中CAT、POD、AAO活性的影響比較顯著，隨著細黃鏈霉菌發酵液濃度的減小，黃芩葉片中CAT、POD、AAO活性總體的趨勢先增加后減小；當細黃鏈霉菌發酵液稀釋到50倍時，黃芩葉片中POD、AAO活性一直比其他濃度的發酵液誘導的黃芩葉片中POD、AAO活性強，而黃芩葉片中CAT活性除了在12h和24h外，其余時間均高于其他濃度的發酵液誘導處理。細黃鏈霉菌發酵液誘導黃芩，其體內的CAT、POD、AAO活性均高于CK，說明細黃鏈霉菌對黃芩根腐病菌的抗病性比較顯著。

細黃鏈霉菌；黃芩；黃芩根腐病；誘導；抗病性

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科多年生草本植物，其莖葉和根均含有總黃酮，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、鎮痛、解熱等作用［1］。生產上，黃芩根腐病、根結線蟲病、白粉病和葉枯病等蔓延較快，尤以黃芩根腐病危害較嚴重。黃芩根腐病為土傳病害，病原菌為半知菌亞門腐皮鐮孢霉菌，寄生在土壤中，待到條件適宜時先侵染幼苗根部和莖基部，造成根部腐爛，嚴重時導致全株死亡。根腐病病原菌產生的分生孢子可以通過水流或土壤進行擴散［2－3］。黃芩根腐病主要以化學農藥防治，此方法雖見效快，但具殘留污染環境。生物農藥主要通過農用抗生素產生能抑制或殺死作物的病原菌的微生物次生代謝產物［4］，生物農藥防治病害不但無污染，而且對處理的生物幾乎不產生影響，更不會破環生態平衡。應用根際細菌和植物的內生放線菌不但能拮抗病原菌而且能促進植物生長［5－7］，細黃鏈霉菌（Streptmyces microflavus）是鏈霉菌屬放線菌，對細菌、酵母菌、真菌都有抑制作用［8］。用誘導劑能誘導植物內源信號分子積累并傳輸至全株，導致植物產生一些抗病相關的酶而獲得長期的抗性［911］，達到防治病害的目的。目前，有關細黃鏈霉菌誘導黃芩，使其產生抗病性的研究還鮮有報道。因此，筆者用不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液浸泡黃芩幼苗的根，研究黃芩在不同生長時間的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸氧化酶（AAO）活性的影響，以探討細黃鏈霉菌對黃芩根腐病菌的抗病性反應，為黃芩根腐病的生物防治提供參考。

1材料與方法

1．1試驗材料

黃芩種子購于商洛天士力醫藥有限公司，黃芩根腐病菌由商洛學院生物醫藥與食品工程學院微生物實驗室從黃芩根部分離鑒定，細黃鏈霉菌購于陜西省微生物研究所。培養基為PDA固體培養基、高氏一號（GA）固體培養基、種子培養基及發酵培養基。

1．2黃芩根腐病菌菌液和細黃鏈霉菌發酵液的制備

將活化的黃芩根腐病菌菌液濃度稀釋為107cfu／mL的菌懸液，即得黃芩根腐病菌菌液。

將活化的細黃蓮霉菌接種于裝有100mL種子培養基的250mL錐形瓶中，在28℃、150r／min振蕩培養5d，以20%的接種量轉接到100mL發酵培養基的錐形瓶中，振蕩培養5d，發酵液經0．22μm微孔濾膜過濾得濾液即為細黃鏈霉菌發酵液。

1．3黃芩幼苗的培養與采樣

挑選飽滿、大小一致的黃芩種子蒸餾水清洗，1%NaClO3消毒10min，再用蒸餾水沖洗，風干后放在鋪有雙層濾紙的干凈培養皿中，每皿放100粒。于25℃的培養箱培養，保持種子濕潤。待黃芩幼苗約5cm左右，分別用CK（無菌水）、細黃鏈霉菌發酵濾液濃度稀釋為10倍，20倍，50倍，100倍的溶液浸泡黃芩幼苗根8h后，移栽至上口徑為10cm的小花盆中用沙質土壤培養，然后在每株黃芩根部注入5mL的黃芩根腐病菌菌懸液，待幼苗生長至4葉期時，每隔12h采樣酶活性測定。

1．4酶活性的測定

過氧化氫酶（CAT）活性測定采用比色法［12］，樣品在1min內240nm處吸光度每變化0．1為1個CAT酶活單位；過氧化物酶（POD）活性測定用愈創木酚法［13］，抗壞血酸氧化酶活性測定用淀粉溶液及碘液滴定法［13］。

1．5數據處理

數據的統計分析采用Mircosoft office 2003 Excel和SPSS17．0進行。

2結果與分析

2．1黃芩幼苗的CAT活性

如圖1所示，在不同時間誘導處理條件下，不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液對黃芩幼苗的CAT活性均有顯著的影響。各處理幼苗的CAT活性均大于CK，隨著發酵液濃度的升高，黃芩幼苗的CAT活性也有所增加。在36h時，不同濃度處理的黃芩CAT活性均達到最高峰，但發酵液濃度稀釋50倍的黃芩CAT活性的最高峰［139．12U／（g·min）］比CK處理的［101．24U／（g·min）］高37．42%，比稀釋10倍處理的［110．27U／（g·min）］高26．16%，比稀釋20倍處理的［136．34U／（g· min）］高2．00%，比稀釋100倍處理的［115．61U／（g·min）］高20．34%，可見，細黃鏈霉菌發酵液最佳的誘導抗病效果為稀釋50倍。經多重比較，CK和稀釋10倍的黃芩發酵液CAT活性無顯著差異（P＝0．080＞0．05）；但CK和稀釋10倍的黃芩發酵液CAT活性分別與稀釋20倍、50倍及100倍間的差異顯著（P＜0．05）；發酵液稀釋20倍和50倍的黃芩CAT活性間無顯著差異（P＝0．531＞0．05），但均與CK、稀釋10倍、100倍間的差異顯著（P＜0．05）；稀釋100倍的黃芩CAT活性分別與CK、稀釋10倍、20倍及50倍間的差異顯著（P＜0．05）。

圖1 不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液處理黃芩的CAT活性Fig．1 CAT activity of S．baicalensis seedlings inoculated with different concentrations of S．microflavus fermentation broth

2．2黃芩幼苗的POD活性

由圖2可知，不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液對黃芩幼苗的POD活性均有顯著的影響。其中CK、發酵液濃度稀釋10倍、20倍、50倍處理的黃芩POD活性均在24h時達到峰值，分別為279．56U／（g·min）、302．23U／（g·min）、312．61U／（g· min）、386．32U／（g·min），而發酵液濃度稀釋為100倍處理的黃芩POD活性均在36h達到峰值，酶活為315．61U／（g·min）。可見，發酵液濃度稀釋50倍處理的黃芩POD活性峰值最大，比CK、發酵液濃度稀釋10倍、20倍、100倍處理的黃芩POD活性的峰值分別高38．19%、27．82%、23．58%和22．40%。說明，POD活性隨著發酵液濃度的增加而增加，且高濃度的發酵液不利于黃芩幼苗的POD產生，低濃度的發酵液能促進黃芩幼苗產生POD。用多重因素分析，發酵液稀釋10倍、20倍的黃芩POD活性無顯著差異（P＝0．289＞0．05），而其分別與CK、發酵液稀釋50倍、100倍差異顯著（P＜0．05）；發酵液稀釋20倍、100倍的黃芩POD活性無顯著差異（P＝0．114＞0．05），而其分別與CK、發酵液稀釋10倍、50倍差異顯著（P＜0．05）；CK、發酵液稀釋50倍的黃芩POD活性兩兩之間差異性顯著，并且分別與其他發酵液濃度差異比較顯著（P＜0．05）。

圖2 不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液處理黃芩的POD活性Fig．2 POD activity of S．baicalensis seedlings inoculated with different concentrations of S．microflavus fermentation broth

2．3黃芩幼苗的AAO活性

從圖3看出，不同時間內細黃鏈霉菌對黃芩幼苗的抗壞血酸氧化酶（AAO）活性均有顯著的影響，且均隨著時間的增加其AAO活性逐漸增加，到36h時出現峰值。不同濃度的發酵液處理黃芩，其AAO活性均大于CK。發酵液稀釋50倍黃芩幼苗的AAO活性［50．69U／（g·min）］峰值最高，比CK、稀釋10倍、20倍、100倍黃芩幼苗的AAO活性峰值分別高25．97%、17．31%、8．22%、4．26%。說明，誘導促進黃芩幼苗的AAO活性細黃鏈霉菌發酵液最佳稀釋濃度為稀釋50倍。

圖3 不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液處理黃芩的AAO活性Fig．3 AAO activity of S．baicalensis seedlings inoculated with different concentrations of S．microflavus fermentation broth

3結論與討論

1）用誘導劑誘導植物，植物產生的SAR能提高植物的抗病性，如果病原菌侵染植物，植物體內的內源信號分子開始大量積累，信號分子開始向整個植株各個器官傳輸，然后啟動相關防御基因的表達，使植物體內的防御酶系活化、植物保衛素、木質素合成及產生病程相關蛋白（PR蛋白），從而寄主植物可以獲得長期的抗性。如植物沒有受病原菌侵染，用誘導劑誘導后，同樣植物體內能積累大量的內源信號分子，并且向全株傳輸，植物可以獲得長期的抗性［1415］。本研究用不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液分別誘導處理黃芩幼苗的根，幼苗移栽后在黃芩幼苗根部接種黃芩根腐病菌，待幼苗生長至4葉期時，不同時間內細黃鏈霉菌對其體內CAT、POD、AAO活性隨著濃度的升高先上升后下降，同一濃度隨著時間的增加先升高后下降。不同濃度細黃鏈霉菌發酵液處理黃芩，其體內的3種酶活性均高于CK，并且均是細黃鏈霉菌發酵液濃度稀釋50倍的黃芩體內的3種酶活性最高。不同時間分別用CK和不同濃度的發酵液處理黃芩，其AAO活性兩兩之間差異顯著（P＜0．05），而CAT和POD活性在不同濃度和不同時間有差異顯著的（P＜0．05），也有不顯著的（P＞0．05）。過氧化氫酶是在生物正常細胞內清除氧自由基和生物防御系統的關鍵酶之一，病原菌感染后引起氧化應激在不同程度上激活了體內的抗氧化防御體系，產生抗病作用。CAT活性的升高可能是因植物體內的過氧化氫產物增多而啟動的應激體制，當植物體內過氧化氫產物積累到一定水平時，超出了自身調節的值，酶活性就開始降低。POD活性對植株體內的內源激素合成有一定的調節功能。AAO活性表現出了“低濃度促進高濃度抑制”的濃度雙重效應，因此，不同濃度的細黃鏈霉菌發酵液誘導黃芩，可以使黃芩植株增強防御反應，進而增強其抗病性。

2）陳杰等［16］篩選出的多產色鏈霉菌（S．polychromogenes）、球孢鏈霉菌球孢亞種（S．globisprus subsp．Globisporus）及銹赤蠟黃鏈霉菌（S．rubiginosohelvolus）對馬鈴薯土傳病病原立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）及硫色鐮刀菌均有較強的拮抗作用。段佳麗［17］通過田間試驗，證實了生防放線菌防治丹參根腐病菌的效果顯著，同時證明了放線菌劑作用的微生態機理。中生菌素除了能抑制病原菌，還能誘導水稻植株體內的PAL、POD、PPO等防御酶活性大幅提高，起到了防治病害的作用［18］。許英俊等［19］研究了生防菌接種后可提高草莓新葉和根系PPO活性，產生誘導抗性。薛磊［20］研究出了防治棉花黃萎病的高效多功能生防放線菌菌株。李增波等［21］研究表明，生防菌劑對草莓有較強的防病作用，同時還能使草莓植株健壯旺盛，根系發達，具有促生效果。這些研究結果與本研究結果基本一致。隋麗等［22］用放線菌769發酵液對水稻的抗性誘導機制做了研究，結果發現769菌株發酵液可抑制水稻體內過氧化氫酶（CAT）的活性，提高POD和PAL活性。此研究的生防放線菌抑制水稻體內CAT的活性與本研究的結果相反，還需要進一步探討。

［1］梁 英，韓魯佳．黃芩中黃酮類化合物藥理學作用研究進展［J］．中國農業大學學報，2003，8（6）：9－14．

［2］蘇淑欣，李 世，劉海光，等．黃芩病蟲害調查報告［J］．承德職業學院學報，2005（4）：82－83．

［3］郭巧生．藥用植物栽培學［M］．北京：高等教育出版社，2004：287－290．

［4］陳敏純，廖美德，夏漢祥．農用抗生素作用機理簡述［J］．世界農藥，2011，33（3）：13－16．

［5］楊海蓮，孫曉璐，宋 未．植物根際促生細菌和內生細菌的誘導抗病性的研究進展［J］．植物病理學報，2000，30（2）：106－110．

［6］Conn V M，Walker A R，Franco C M M．Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana［J］．Molecular Plant－Microbe Interactions，2008，21：208－218．

［7］El－Tarabily K A，Nassar A H，Hardy G，et al．Plant growth promotion and biological control of Pythium aphanidermatum，apathogen of cucumber，by endophytic actinomycetes［J］．Journal of Applied Microbiology，2009，106：13－26．

［8］譚之磊，王來福，肖湘政，等．細黃鏈霉菌005發酵條件優化及在玉米上的應用［J］．中國土壤與肥料，2008 （2）：61－64．

［9］范志金，劉秀峰，劉鳳麗，等．植物抗病激活劑誘導植物抗性的研究進展［J］．植物保護學報，2005，32（1）：87－92．

［10］Sun A Z，Nie S J，Xing D，et al．Nitric Oxide－Mediated Maintenance of Redox Homeostasis contributes to NPR1－Dependent plant innate immunity triggered by lipopolysaccharides［J］．Plant Pathol，2012，160 （2）：1081－1096．

［11］Scalschi L，Vicedo B，Camanes G，et al．Hexanoic acid is a resistance inducer that protects tomato plants against Pseudomonas syringae by priming the jasmonic acid and salicylic acid pathways［J］．Mol Plant Pathol，2013，14（4）：342－355．

［12］高俊鳳．植物生理學實驗技術［M］．北京：世界圖書出版公司，2000：195－199．

［13］張龍翔．生化實驗方法與技術［M］．2版．北京：高等教育出版社，1997：179．

［14］程世亞，袁 澍，席德慧，等．植物系統獲得性抗性的分子機理［J］．生命的化學，2008，28（3）：256－259．

［15］Garcia－Brugger A，Lamotte O，Vandelle E．Early signaling events induced by elicitors of plant defenses ［J］．Mol Plant Microbe In，2006，19（7）：711－724．

［16］陳 杰，楊 琳，郭天文，等．馬鈴薯土傳病原真菌拮抗放線菌的抗病促生作用［J］．西北農林科技大學：自然科學版，2014，42（10）：111－119．

［17］段佳麗．丹參根部病害發生微生態機制與放線菌促生作用研究［D］．楊凌：西北農林科技大學，2013：79－81．

［18］朱茂山．番茄灰霉菌拮抗放線菌及抑菌活性物質研究［D］．沈陽：沈陽農業大學，2014：15－17．

［19］許英俊，薛泉宏，邢勝利，等．3株放線菌對草莓的促生作用及對PPO活性的影響［J］．西北農業學報，2007，16（6）：146－153．

［20］薛 磊．棉花黃萎病生防鏈霉菌的抗病促生作用及其機制研究［D］．楊凌：西北農林科技大學，2012：131－192．

［21］李增波，薛泉宏，粱軍峰，等．一株生防放線菌AL－04的防病促生作用［J］．農藥，2009，48（1）：74－76．

［22］隋 麗，徐文靜，杜 茜，等．放線菌769發酵液對水稻體內主要防御酶活性的影響［J］．吉林農業大學學報，2009，31（4）：382－384，389．

（責任編輯：聶克艷）

Induced Reaction of Streptomyces microflavus to Fusarium solani in Scutellaria baicalensis

LI Duishu

（College of Biomedicine and Food Engineering，Shangluo College，Shangluo，Shaanxi 726000，China）

The cutellaria baicalensis seedlings’roots were first soaked with different concentration of S．microflavus fermentation broth and sterile water（CK）respectively，then the transplanted seedlings’roots inoculated with 5mL F．solani suspension and finally the CAT，POD and AAO activity of the S．baicalensis seedlings with four leaves was determined at different time to study the inhibition effect of S．baicalensis inducted with S．microflavus against F．solani．Results：The concentration of S．microflavus fermentation broth has the significant effect on CAT，POD and AAO activity of the S．baicalensis seedlings and the leaf CAT，POD and AAO activity represents a first increase and then decrease trend overall with decrease of S．microflavusfermentation broth concentration．The leaf POD and AAO activity still is higher than other treatments when S．microflavus fermentation broth is diluted to 50 times but the leaf CAT activity is higher than other treatments except for determination values at 12hand 24h．The leaf CAT，POD and AAO activity of S．baicalensis seedlings treated with S．microflavus fermentation broth is higher than CK，which indicates S．microflavus is of the significant resistance to F．solani of S．baicalensis．

Streptomyces microflavus；Scutellaria baicalensis；Fusarium solani；induction；resistance

S436．412．13

A

1001－3601（2016）02－0072－0089－04

2015－06－10；2016－01－14修回

陜西省教育廳科學研究計劃項目“生防放線菌誘導商洛黃芩抗根腐病及促生性研究”（2013JK0737）

李堆淑（1977－），女，副教授，碩士，從事植物病理生理學及微生物研究。E－mail：lds1202＠163．com