一株產廣譜高效抑菌活性細菌素植物乳桿菌的篩選與鑒定

胡美忠，張新卓，劉蕓

（銅仁職業技術學院，貴州銅仁510025）

一株產廣譜高效抑菌活性細菌素植物乳桿菌的篩選與鑒定

胡美忠，張新卓，劉蕓

（銅仁職業技術學院，貴州銅仁510025）

為獲得產廣譜高效抑菌活性細菌素的乳酸菌，采用agar－spot－test法、瓊脂擴散法結合生理生化和16SrDNA序列同源性分析法從貴州傳統發酵食品中分離、篩選、鑒定乳酸菌并對其產生抗菌物質的生理生化特性進行鑒定。結果表明：從貴州傳統發酵食品中分離出乳酸菌110余株并從中篩選出效果最好的菌株416，鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其產生的抑菌物質為多肽類，對蠟樣芽孢桿菌和李斯特菌有較強的抑制作用，具有作為生物防腐劑應用于食品行業的潛力。

細菌素；抑菌活性；植物乳桿菌

食品防腐幾千年來一直是擋在人們面前的一大難題。據估計，全世界每年有10%～20%的食品損失源于腐敗變質，其經濟損失巨大。為了預防或延緩食品腐敗，人們往往在食品中添加一些防腐劑［1］。防腐劑可分為天然防腐劑和化學防腐劑。以山梨酸鉀、苯甲酸鈉為代表的化學防腐劑因價格低廉、防腐效果較好而廣泛應用于食品加工。但有研究發現［2］，化學防腐劑有誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題，加之消費者對食物的安全、自然、新鮮、味美及營養不被加工過程破壞等要求越來越苛刻，因此，化學防腐劑在食品中的應用越來越受限制。天然防腐劑具有抗菌性強、安全無毒、水溶性和熱穩定性好、作用范圍廣等合成防腐劑無法比擬的優點，正逐步取代化學防腐劑。開發高效、安全、穩定的天然防腐劑已成為食品添加劑研究的熱點。采用有益微生物發酵生產天然防腐劑成本低，生產周期短，并可通過現代生物技術手段對菌種進行改造、代謝調控、分子修飾等操作提高產品產量和質量。因此，有益微生物來源的天然防腐劑開發具有廣闊的前景。

人類利用乳酸菌已有數千年的歷史，乳酸菌及其發酵產物被公認為安全的物質，可直接應用于食品。乳酸菌的代謝過程產生乳酸、檸檬酸、草酸和酒石酸等有機酸，該有機酸可破壞細菌的細胞膜改變其通透性，進而具有殺死致病菌的作用［3］。同時，乳酸菌在代謝過程中可產生過氧化氫，而過氧化氫分解產生的活性氧具有極強的氧化能力［4］。耿彥生等［5］研究發現，乳酸對于過氧化氫的殺菌效果具有增強及穩定作用。部分乳酸菌在代謝過程中還可產生活性多肽——細菌素，大部分細菌素能抑制與其產生菌近緣菌株的生長繁殖，其中有極少部分細菌素具有廣譜抗菌活性故具有應用于食品防腐、醫藥衛生等方面的潛力。近年來，分離自乳酸菌的細菌素因其殺菌功效好，來源安全，可靠性高等特性受到越來越多的矚目［6］。如，產自乳酸鏈球菌的細菌素Nisin能抑制食品中腐敗菌和致病菌等革蘭氏陽性菌，現在已被廣泛應用于罐頭和乳制品的防腐；但Nisin對革蘭氏陰性細菌、酵母菌、霉菌及病毒等無抑制作用，故而具有一定的局限性［7－8］。因此，篩選具有高效廣譜抑菌效果的乳酸菌抗菌肽作為一種天然防腐劑仍是國內外研究的熱點［9－10］。目前，國內外專家就這方面工作做了大量研究。如，Meizhong H等［11］發現，植物乳桿菌素163具有廣譜抑菌作用而具有應用于食品防腐的潛力；饒瑜等［12］篩選出用于四川泡菜生物保鮮的產細菌素乳酸菌。

貴州擁有豐富的具有各民族特色的發酵食品及特殊的生境，也具有篩選產高效廣譜乳酸菌細菌素乳酸菌的優勢。因此，從貴州傳統發酵食品中極有可能篩選出應用前景好的乳酸菌菌株。為此，筆者采用agar－spot－test方法從貴州傳統發酵食品分離篩選乳酸菌，以瓊脂擴散法復篩抑菌效果最好的乳酸菌，采用生理生化和16SrDNA序列同源性分析法鑒定所選乳酸菌，并對其產生的抗菌物質抑菌活性進行檢測，以期獲得產廣譜高效抑菌活性細菌素乳酸菌。

1材料與方法

1．1供試材料

1．1．1樣品 貴州傳統發酵食品（酸菜、酸肉、腌魚等）采集于貴州省銅仁市、貴陽市、安順市和遵義市。

1．1．2指示菌 金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、大腸桿菌（ATCC 25922）、李斯特菌（ATCC 19114）購自美國標準菌庫；蠟樣芽孢桿菌（AS 1．184）購自中國普通微生物菌種保藏中心，由南京農業大學食品科技學院酶工程室保藏提供。

1．1．3培養基1）MRS培養基。培養乳酸菌，培養溫度37℃，靜置培養。配方：蛋白胨10．0g，牛肉膏5．0g，酵母粉4．0g，葡萄糖20．0g，吐溫－80 1mL，K2HPO4·3H2O 1．52g，CH3COONa 3．02g，檸檬酸三銨2．0g，MgSO4·7H2O 0．2g，MnSO4·H2O 0．03g，瓊脂（固體）18．0g，蒸餾水1 000mL，pH 6．2，121℃，20min滅菌。2）LB培養基。培養細菌，培養溫度37℃。配方：胰蛋白胨10g／L，NaCl 10g／L，酵母浸膏5g／L，蒸餾水1 000mL，pH 7．0，121℃，20min滅菌。

1．1．4試劑 革蘭氏染色試劑盒（杭州百思生物技術有限公司），細菌基因組提取試劑盒（Bacterial DNA Kit（200），OMEGA），Taqtm DNA聚合酶（TaKaRa），Gel Extraction Kit（TaKaRa），過氧化氫酶（Sigma）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、α－凝乳蛋白酶均由Sigma出產。

1．2乳酸菌的分離純化

利用乳酸菌在代謝過程中產生有機酸能使碳酸鈣溶解出現溶鈣圈的原理，在MRS培養基中添加碳酸鈣篩選產酸的菌落，再利用過氧化氫酶、革蘭氏染色測試。即在無菌條件下用生理鹽水將樣品稀釋成不同濃度，取10－3樣品稀釋液涂布于混有0．3%碳酸鈣MRS固體培養基上。37℃培養48h后，選取具有明顯溶鈣圈的菌落劃線于MRS固體培養基上繼續純化，純化的菌落進行過氧化氫酶測試、革蘭氏染色鏡檢。篩選出過氧化氫酶陰性、革蘭氏染色陽性的菌落，初步認定為乳酸菌，取對數期的菌液，用含25%甘油作為保護劑的MRS肉湯培養基－70℃下保藏待用。

1．3產細菌素乳酸菌的初篩

利用agar－spot－test方法［13－14］篩選純化的乳酸菌是否產生抗菌物質。方法：純化的乳酸菌在無菌條件下點接種于MRS固體培養基上，37℃培養48h長出菌落后，向MRS平板傾倒混有指示菌金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的LB培養基（含1．5%瓊脂），37℃繼續培養24h后觀察。乳酸菌菌落周圍出現抑菌圈且抑菌圈直徑大于10mm可初步判定產生抑菌物質。

1．4產細菌素乳酸菌的復篩

初篩的各菌株經MRS培養基活化后，種子液按1%（V／V）的比例接種于100mL MRS培養基，于37℃條件下靜置培養24h，用8 000r／min的速度離心15min，除去菌體，利用瓊脂擴散法定量測試各菌株的抑菌活性［15－16］，篩選出活性較強的菌株。將活性較強菌株的無細胞上清液分成2份，一份用3NNaOH調節pH至5．5，以用乳酸調節pH至5．5 的MRS培養基作為空白對照，采用瓊脂擴散法測試其抑菌活性，借以排除酸抑菌活性的影響；另一份加入過氧化氫酶，以不加過氧化氫酶的無細胞上清液作為對照，瓊脂擴散法測試其抑菌活性，借以排除過氧化氫抑菌活性的影響。

1．5目標菌株的生理生化及16SrDNA鑒定

選取從傳統發酵食品篩選出的1株排除酸及過氧化氫影響后仍具有較好活性的菌株，首先對其進行生理生化鑒定，包括革蘭氏染色、細胞形態、菌株生長能力，產酸產氣、有無鞭毛以及對碳水化合物的發酵能力測試。然后對其進行16SrDNA鑒定。PCR引物：16SF：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，16SR：5’－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3’。PCR擴增程序：用DNA Engine Peltier Thermal Cycler（Bio－Rad，Mex－ico）進行DNA放大，95℃預變性4min；95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循環30次；最后72℃聚合10min。PCR擴增產物用TakaRa Gel Extraction Kit（中國，南京）純化，送Genscript Bio．公司（中國，南京）進行測序。得到的序列與DNA Databases進行同源性匹對。

1．6目標菌株產抑菌物質蛋白酶敏感性測試

精密配制胰蛋白酶（2．5KU／mg）、蛋白酶K （30U／mg）、α－凝乳蛋白酶（1KU／mg）和胃蛋白酶（3KU／mg）溶液5mg／mL，取0．2mL各酶溶液于離心管中，并加入已調節至各酶最適pH的目標菌株無細胞上清液0．8mL，以加0．2mL無菌水于0．8mL目標菌株無細胞上清液的溶液為對照，37℃水浴3h后調節pH至5，測試目標菌株的抑菌活性。

1．7目標菌株產抑菌物質對其他細菌的抑菌效果

目標菌株的無細胞上清發酵液排除有機酸和過氧化氫影響后，用瓊脂擴散法測試其對李斯特菌和蠟樣芽胞桿菌的抑菌活性。

2結果與分析

2．1乳酸菌的分離純化與篩選

2．1．1分離純化 從貴州傳統發酵食品中篩選出110株乳酸菌。說明，該試驗方法簡便高效，能迅速、大量地從發酵食品中純化乳酸菌。此外，貴州傳統發酵食品的制備主要通過乳酸菌發酵獲得，乳酸菌發酵不僅使發酵食品具備特殊的風味，而且對于發酵食品的防腐具有特別的貢獻。從發酵食品中分離乳酸菌，篩選出能產細菌素的乳酸菌是一個極好的樣品來源。如，袁瑋［17］曾在貴州省苗族腌酸湯中篩選出抑菌效果顯著的植物乳桿菌L6。

2．1．2產細菌素乳酸菌的初篩 常用乳酸菌產抑菌物質的篩選方法：菌落活化→接種→培養后離心得上清液→抑菌試驗。此方法工作量大，一批次測試的菌株數不多。對于大量菌株而言，工作量繁重。利用agar－spot－test方法則可迅速地定性篩選出能產抑菌物質的乳酸菌，同一批次可測試數十株乳酸菌，可節省試驗時間。利用agar－spot－test從純化的110株乳酸菌中篩選得到45株具有較強抑菌活性的菌株（圖1）。

圖1 Agar－spot test法初篩產廣譜抗菌細菌素部分乳酸菌的抑菌效果Fig．1 The antibacterial effect of some screened bacteriocin L．plantarumstrains with efficient broad－spectrum bacteriostatic activity by Agar－spot test

2．1．3產細菌素乳酸菌的復篩 復篩就是排除酸及過氧化氫的影響，確定產生抗菌作用的是細菌素。該試驗從110株菌株中篩選得到編號為416的菌株，其能產生對金黃普通球菌（ATCC25922）和大腸桿菌（ATCC25923）具有較強抑菌活性的物質。

2．2菌株416的生理生化及16SrDNA鑒定

從表可見，菌株416的過氧化氫酶反應呈陰性，發酵葡萄糖產酸、不產氣，無運動性，不產硫化氫；同時，該菌株能發酵纖維二糖、七葉靈、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸鹽、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖、海藻糖和木糖。將菌株416的16SrDNA基因序列與www．ncbi．nlm．nlh．gov網站GENBANK＋EMBL＋DDBJ＋PDB基因庫BLAST序列進行比對發現，與4株植物乳桿菌的相似性均達100%。因此，綜合形態學、生理生化特性，通過對照《伯杰氏細菌鑒定守則》及《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》的鑒定項目及16SrDNA同源性比較結果，可以把菌株416歸為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表 菌株416的生理生化特性Table Physiological and biochemical characteristics of 416strain

2．3目標菌株416產抑菌物質的蛋白酶敏感性測試

從圖2可見，菌株416產的抑菌物質對蛋白酶敏感。其中，Typsin的抑菌圈直徑為（12．76± 0．59）mm，Protease K的抑菌圈直徑為（13．01± 0．21）mm，α－Chymotrypin的抑菌圈直徑為（12．89±0．23）mm，Pepsin的抑菌圈直徑為0mm，CK的抑菌圈直徑為（14．01±0．34）mm。表明，胃蛋白酶能使其完全失去活性，胰蛋白酶、蛋白酶K 和α凝乳蛋白酶能使其部分失活。由此也表明，此抑菌物質是一類蛋白類（多肽）物質。細菌素是一類由細菌核糖體合成的抗菌蛋白類物質，菌株416所產抑菌物質在排除酸抑制及過氧化氫抑制后，經過蛋白酶水解試驗證實其蛋白性質，由此可確定此抑菌物質是一種細菌素。

圖2 菌株416產抑菌物質的蛋白酶敏感性Fig．2 Sensibility of bacteriostatic substance produced by strain 416to different proteases

2．4菌株416產細菌素對其他菌的抑菌效果

試驗表明，菌株416所產細菌素是一種廣譜抑菌活性細菌素，不但對革蘭陽性菌有抑菌效果，對革蘭陰性菌也有抑菌效果。其中，對金黃色葡萄球菌（G＋菌）的抑菌圈直徑大于18mm，對大腸桿菌（G－菌）和蠟樣芽孢桿菌（G＋菌）的抑菌圈直徑為13～18mm，對李斯特菌（G＋菌）的抑菌圈直徑為9～13mm。

大部分細菌素只能抑制與其親緣關系較近的細菌，只有極少部分細菌素具有廣譜抑菌活性，這部分細菌素是研究的重點［18－19］。菌株416能產對G＋和G－菌都有抑制效果的細菌素，其中，金黃色葡萄球菌的抑菌圈達18mm以上，說明其抑菌活性很強。從初步的抑菌譜試驗可以得知，此菌株具有廣譜抑菌活性，應用前景較好。

3結論與討論

乳酸菌產生的抑菌物質很多，有酸性物質、過氧化氫、CO2和細菌素等。篩選乳酸菌產廣譜抑菌作用的細菌素，必須先確定能產生抗菌物質，再排除酸性物質和過氧化氫的干擾，確定抑菌物質是細菌素（蛋白類）。本試驗從貴州省特有傳統發酵食品中逐步篩選出菌株416，在排除有機酸和過氧化氫等干擾因素后，其發酵液對G＋和G－菌仍有非常高的抑菌活性，通過生理生化試驗和16SrDNA序列同源性分析鑒定，此菌株為植物乳桿菌。對此菌株產生的抑菌物質進行進一步研究后確定其為蛋白類物質，具有作為生物防腐劑應用于食品行業的潛力。

乳酸菌細菌素指由乳酸菌代謝分泌產生的一類細菌素，乳酸菌細菌素來源上的安全性及效果上的顯著性使其越來越受到重視，如利用部分乳酸菌細菌素能產生廣譜抗菌物質，能促生長，保健及治療疾病的功能制備成無毒副作用、無殘留和無細菌耐藥性的一類環保型飼料添加劑。利用細菌素無免疫原性及對人無毒副作用等特點，在食品工業領域作為食品添加劑等。因而乳酸菌細菌素在食品工業上有極好的應用前景。下一步的工作是研究菌株416產細菌素的一級結構，熱穩定性、酸堿穩定性及抑菌機理，為后續應用于食品防腐奠定理論基礎。

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（責任編輯：王 海）

畜牧·獸醫·水產

Animal Husbandry·Veterinary·Fishery

Screening and Identification of a Lactobacillus plantarumStrain with Efficient Broad－spectrum Bacteriostatic Activity

HU Meizhong，ZHANG Xinzhuo，LIU Yun
（Tongren Polytechnic，Tongren，Guizhou550025，China）

L．plantarumstrains were screened from Guizhou traditional fermentation food by agar－spottest，then the L．plantarumstrain with the best bacteriostatic effect was screened by agar diffusion method and finally the antibiotic substance of the L．plantarumstrain screened by physiological and biochemical identification and 16SrDNA sequence homology analysis was identified to obtain L．plantarumstrains with efficient broad－spectrum bacteriostatic activity．Results：110 L．plantarumstrains are screened from Guizhou traditional fermentation food and stain 416with the best bacteriostatic effect is screened from 110 L．plantarumstrains．The antibiotic substance produced from stain 416（L．plantarum）is polypeptide，which has the strong inhibition effect on Bacillus cereus and Listeria monocytogenes and can be used as a biological preservative in food industry．

bacteriocin；bacteriostatic activity；Lactobacillus plantarum

S181

A

1001－3601（2016）02－0074－0096－04

2015－10－24；2016－01－20修回

銅仁市科技計劃項目“食品的天然防腐劑——產廣譜高效乳酸菌細菌素篩選及應用研究”［銅市科研（2012）61－1］

胡美忠（1981－），男，副教授，博士，從事食品微生物研究。E－mail：42554573＠qq．com