青天葵DXR基因編碼蛋白的生物信息學分析

黃瓊林，何 瑞，詹若挺

（1．廣東醫學院，廣東湛江524023；2．廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心，廣東廣州510006；3．嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東廣州510006）

青天葵DXR基因編碼蛋白的生物信息學分析

黃瓊林1，何 瑞2，3＊，詹若挺2，3

（1．廣東醫學院，廣東湛江524023；2．廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心，廣東廣州510006；3．嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東廣州510006）

為后期青天葵DXR基因的全長克隆、功能鑒定和調控研究奠定基礎，采用生物信息學方法對前期通過轉錄組測序獲得的青天葵DXR基因編碼蛋白序列進行分析。結果表明：NfDXR序列包含457個氨基酸，分子量約為49．72Ku，為親水性、混合結構型蛋白質。NfDXR屬于1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶超級家族，含有DXR功能域、2個NAPDH結合基序和2個DXR活性位點基序，不具有跨膜結構域和信號肽結構。NfDXR與其他單子葉植物DXR同源性高，其中與鐵皮石斛DXR的序列相似度達90%。

1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶；青天葵；生物信息學

1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase，DXR）是植物萜類生物合成途徑——MEP途徑的關鍵酶基因之一［1］。研究發現［2－3］，過表達DXR基因可以提高植物萜類化合物的含量，表明DXR基因是調控萜類生物合成的有效靶點。目前，DXR基因已經從陽春砂［4］、高良姜［5］、秦艽［6］、雷公藤［7］、滇龍膽［8］等藥用植物中成功克隆。

嶺南地區名貴中藥青天葵為蘭科多年生草木植物毛唇芋蘭（Nervilia fordii（Hance）Schltr．）的全株或葉片，在臨床上常用于治療小兒呼吸道和肺部疾病［9］。目前，青天葵野生資源已經基本枯竭，而人工栽培青天葵由于面臨萌發條件苛刻、種苗稀缺等瓶頸問題，無法生產足夠的青天葵滿足臨床和市場需求。青天葵植物研究表明，萜類成分是青天葵的主要有效成分之一［10－11］。在化學成分比較明確的情況下，利用植物基因工程技術調控DXR等萜類生物合成功能基因的表達，從而提高青天葵萜類有效成分的含量，進而在整體上提高青天葵藥效，是當前緩解青天葵資源緊缺的途徑之一。

在前期研究中，廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心課題組完成了青天葵全轉錄組RNA－seq測序，共獲得142 220條青天葵功能基因，其中包括1條長度為1 731bp的青天葵DXR基因cDNA序列［12］。本研究采用生物信息學方法對DXR基因編碼的氨基酸進行理化特征、保守功能域、跨膜結構域、信號肽結構、二級結構組成等分析，明確青天葵DXR基因的分子功能和特點，為后續青天葵DXR基因全長的克隆以及利用其促進青天葵萜類有效成分的積累奠定基礎。

1材料與方法

1．1DXR氨基酸序列來源

將在青天葵轉錄組數據中獲得的DXR基因序列，翻譯成氨基酸序列，并結合青天葵的拉丁名，命名為NfDXR。另外，在Genbank數據庫下載鐵皮石斛、陽春砂、高良姜等植物DXR氨基酸序列，用于DXR序列多重比對和系統發育分析。

1．2生物信息學分析

采用表中的在線或離線軟件對NfDXR進行理化特征、保守功能域、二級結構、三級結構以及系統發育分析等生物信息學分析。

表NfDXR生物信息學分析所用的主要軟件Table Bioinformatics software used in this study

2結果與分析

2．1NfDXR的理化特征

ExPASY ProtParam在線工具分析表明，NfDXR包含457個氨基酸，相對分子量為49．72Ku，等電點為6．22。脂溶性指數為98．01，總平均親水性指數為－0．024。ExPASY Protscale分析結果顯示，NfDXR無明顯疏水區域，多肽鏈整體呈親水性，為親水性蛋白。

2．2NfDXR的保守功能域

如圖1所示，NfDXR在63～191、205～288和320～443位氨基酸分別存在DXP＿reductoisom、DXP＿redisom＿C和DXPR＿C等3個特異性保守功能域，歸屬于1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶超級家族；NfDXR在13～457位氨基酸間具有1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase）功能域，說明其具有1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶的功能。

圖1 NfDXR的保守功能域Fig．1 Conserved domain of NfDXR

圖2 NfDXR的跨膜結構域Fig．2 Putative transmembrane region of NfDXR

2．3NfDXR的跨膜結構域及信號肽

如圖2所示，NfDXR整體多肽鏈不含跨膜結構域，均位于細胞膜外。SignalP分析結果也發現，NfDXR不含信號肽結構。由此推測，NfDXR是不與膜脂結合的非分泌性蛋白。

2．4NfDXR的二級結構

SOPMA分析結果（圖3）表明，NfDXR的二級結構由α－螺旋、延伸鏈、β－轉角和不規則盤繞構成，其中α－螺旋和不規則盤繞是主要的組成元件，在多肽鏈中分布比較集中，而另外2種元件延伸鏈和β－轉角則分布情況相對分散。因此，從整體二級結構來看，NfDXR屬于混合結構型蛋白質。

圖3 NfDXR的二級結構Fig．3 Secondary structure prediction of NfDXR

2．5NfDXR的多重序列比對

NfDXR與其他植物DXR的氨基酸序列多重比對（圖4）顯示，不同DXR在70位氨基酸后的序列具有較高的連續相似性，說明DXR在不同植物中存在序列和功能的高度保守性。其中，在其N－端含有2個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）結合基序GSTGSIGT和LAAGANV，在多肽鏈中部含有2個DXR活性位點基序PADSEHSA和NKGLEVIEAHY。

圖4 不同植物DXR氨基酸序列的多重比對Fig．4 Multiple alignment of DXR sequences from various plants

2．6系統發育樹

10種不同植物DXR蛋白的系統發育樹如圖5所示，青天葵、鐵皮石斛、高良姜、陽春砂等單子葉植物來源DXR聚集在一起，其中NfDXR與同為蘭科的鐵皮石斛DXR同源性最高，序列相似度可達90%；而擬南芥等雙子葉植物來源DXR則聚成另外一個分支。

圖5 不同DXR的系統發育樹Fig．5 Phylogenetic tree of different DXRs

圖6 NfDXR的三級結構Fig．6 Tertiary structure prediction of NfDXR

2．7NfDXR的三級結構

Swiss－model三級結構預測（圖6）顯示，NfDXR的功能結構域在空間結構上折疊成V形，V形的兩臂由N端與C端構成。N端臂內含有2個NADPH結合基序；V形的底部，即N端臂與C端臂結合域內藏有2個DXR活性位點基序。

3結論與討論

DXR作為植物萜類生物合成MEP途徑的第2個酶，將DXP催化生成MEP這一萜類合成重要前體，由于DXR也是硫胺素（VB1）和吡哆醇（VB6）生物合成的前體物質。因此，DXR主導的催化反應是MEP途徑的碳流分支點，DXR也被認為是MEP途徑的關鍵酶之一。Mahmoud等［2］在胡椒薄荷中過量表達DXR基因，可促進葉片中薄荷油等單萜的合成，使薄荷精油量提高50%。Wu等［3］從丹參發根中克隆得到DXR基因，發現其表達量與高滲透壓和酵母真菌激發子呈正相關，并與二萜類成分丹參酮的積累相關。DXR突變還影響植物葉綠素、赤霉素和脫落酸等物質的合成，導致植株出現白化、矮化等異常表型［13］。因此，DXR不僅是植物萜類生物合成的重要調控靶點，還對植物的生長發育有重要的影響。

本研究在青天葵轉錄組高通量測序數據的基礎上，采用生物信息學方法對青天葵1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶進行理化特征及分子功能研究得出，NfDXR以α－螺旋和不規則盤繞為主要二級結構組成元件的親水性、非膜脂結合、非分泌性蛋白。NfDXR具有1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase功能域，歸屬于1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶超級家族。多重序列比對、系統發育樹分析和三級結構預測也表明，NfDXR與其他植物DXR蛋白存在高度的同源性，氨基酸序列中均含有共有的結合域（2個NADPH結合基序和2 個DXR活性位點基序），提示NfDXR具有與其他植物DXR類似的功能，即催化前體DXP發生分子重排并在NADPH和二價金屬離子參與下還原生成MEP。

［1］Takahashi S，Kuzuyama T，Watanabe H，et al．1－deoxy－D－xylubose－5－phosphate reductoisomerase catalyzing formation of 2－C－Methyl－D－erythritol－4phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for treenpenoid biosynthesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（17）：9879－9884．

［2］Mahmoud S S，Croteau R B．Metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reducoisomerase and menthofuran synthase［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（15）：8915－8920．

［3］Wu S J，Shi M，Wu J Y．Cloning and characterization of 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase gene for diterpenoid tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza（Chinese sage）hairy roots［J］．Biotechnol Appl Biochem，2009，52（Pt1）：89－95．

［4］楊錦芬，阿迪卡利，陳蔚文，等．陽春砂葵1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶基因的克隆及表達分析［J］．廣州中醫藥大學學報，2010，27（5）：510－516．

［5］張春榮，楊 全，陳虎彪，等．高良姜葵1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶cDNA克隆和表達調控［J］．中國中藥雜志，2012，37（21）：3208－3214．

［6］祝傳書，陳 欣，郭 嘉，等．雷公藤1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶基因（TwDXR）的克隆與表達分析［J］．農業生物技術學報，2014，22（3）：298－308．

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［8］張曉東，趙 靜，李彩霞，等．滇龍膽葵1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶基因GrDXR的克隆、序列分析和原核表達［J］．中草藥，2014，45（16）：2378－2784．

［9］陳蔚文．嶺南本草（二）［M］．廣州：廣東科技出版社，2010：326－351．

［10］梅全喜．青天葵的化學成分藥理作用與臨床應用研究進展［J］．中華中醫藥學刊，2008，26（10）：2239－2241．

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（責任編輯：劉忠麗）

Bioinformatics Analysis of Gene DXRfrom Nervilia fordii

HUANG Qionglin1，HE Rui2，3＊，ZHAN Ruoting2，3
（1．Guangdong Medical University，Zhanjiang，Guangdong524023；2．Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006；3．Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan，Ministry of Education，Guangzhou，Guangdong510006，China）

1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase is one of the rate－limiting key enzymes of plant MEP terpenoids biosynthesis pathway．Enhancing DXR expression could promote the synthesis of terpenoid．In order to lay the foundation for overall length coloning，functional identification and regulation of gene DXRfrom N．fordii，in later period，bioinformatics methods were employed to analyze DXR protein sequence acquired from N．fordii transcriptome data．Results：NfDXR，containing 457 amino acids，was a hydrophilic and structurally hybrid protein with a molecular weight at 49．72Ku．NfDXR contained a 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase functional domain，two NAPDH binding motifs，two DXR active motifs and none signal peptide and transmembrane region．NfDXR shared high homology with othrer DXR from monocotyledons，in which the similarity with DXR from Dendrobiumofficinalereached 90%．

1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase；Nervilia fordii；bioinformatics analysis

S567．23＋9

A

1001－3601（2016）02－0082－0129－04

2015－07－10；2016－01－10修回

國家自然科學基金項目“中藥青天葵分枝發育相關基因的研究”（30701090）；廣東省自然科學基金博士啟動項目“中藥青天葵黃酮類生物合成途徑關鍵酶基因CHS和FLS的功能和調控研究”（2015A030310519）

黃瓊林（1986－），男，講師，博士，從事醫學生物化學研究。E－mail：perfecthql＠163．com

＊通訊作者：何 瑞（1972－），女，研究員，博士，從事中藥資源可持續利用研究。E－mail：ruihe＠gzucm．edu．cn