黔產吳茱萸的UPLC－MS／MS指紋圖譜分析

張建鋒，劉 文，吳增光，張石宇，王鈺樂，楊道斌

（貴陽中醫學院，貴州貴陽550002）

黔產吳茱萸的UPLC－MS／MS指紋圖譜分析

張建鋒，劉 文＊，吳增光，張石宇，王鈺樂，楊道斌

（貴陽中醫學院，貴州貴陽550002）

為了對吳茱萸的質量控制、研究開發和應用提供科學依據，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1．7μm，100mm×2．1mm），以水（A，含0．05%甲酸）－乙腈（B）為流動相，梯度洗脫；柱溫40℃，流速0．4mL／min，進樣量2μL，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）對其進行相似度評價。結果：建立了吳茱萸UPLC－MS／MS指紋圖譜的共有模式，確定了27個共有峰，并根據對照品和參考文獻指認了11個共有峰，對20批不同產地和品種的吳茱萸藥材相似度進行分析，其相似度在0．90以上。結論：首次建立了吳茱萸藥材UPLC－MS／MS指紋圖譜分析方法，該分析方法快速、靈敏、簡便，可為吳茱萸藥材各品種的質量控制提供依據。

吳茱萸；UPLC－MS／MS；指紋圖譜；質量控制；聚類分析

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實，主產于貴州、廣西、湖南、云南等省區，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉的功效［12］。近年來，吳茱萸新的藥理作用、化學成分和利用新指標控制其提取純化工藝已得到深入研究［36］。黔產吳茱萸一直以來被認為是吳茱萸的道地藥材，且產量大品質好，藥效穩定，為臨床常用藥。吳茱萸由于生長環境、氣候條件等因素影響，其物質基礎存有差異。指紋圖譜分析方法作為控制吳茱萸藥材的質量方法之一，目前在吳茱萸研究過程中已有應用［7－9］，但有關UPLC－MS／MS方法對黔產吳茱萸化學成分進行定性分析研究尚無報道。因此，筆者應用UPLC－MS／MS聯用技術對黔產吳茱萸進行研究，為吳茱萸藥材的質量控制提供參考。

1材料與方法

1．1試驗材料

1．1．1儀器及試劑CQUITY UPLC（美國Waters公司），質譜檢測器（Waters－Xevo TQ），MassL－ynx TM質譜工作站軟件（Waters公司），科導SK8210HP型臺式超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司），Auy220型電子天平（日本島津）。乙腈（色譜純，美國Tedia公司），甲酸（色譜純，CNW公司），屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），0．22μm微孔濾膜（廣州泛宏貿易有限公司），吳茱萸堿（Evodiamine）對照品（中國食品藥品檢定研究院，110802—201409），吳茱萸次堿（Rutecarpine）（中國食品藥品檢定研究院，110801—201207）；吳茱萸內酯（Limonin）（中國食品藥品檢定研究院，110800—201205），乙腈、甲酸為色譜醇，水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1．1．2吳茱萸及其來源 吳茱萸［Euodia rutaecarpa（Juss．）Benth．］分別來自貴州省印江縣（S1）、石阡縣（S2）、松桃縣（S3）、思南縣（S4）、玉屏縣（S5）、榕江縣（S6）、德江縣（S7）、江口縣（S8）和黔西縣（S9），疏毛吳茱萸［Euodia rutaecarpa（Juss．）］分別來自貴州省威寧縣（S10）、金沙縣（S11）、大方縣（S12）、萬江縣（S13）、德江縣（S14）、石阡縣（S15）和綏陽縣（S16），石虎［Euodia rutaecarpa（Juss．）Benth．var．bodinieri（Dode）Huang］分別來自貴州省石阡縣（S17）、沿河縣（S18）、思南縣（S19）和天柱縣（S20）。不同產地及品種吳茱萸樣品經貴陽中醫學院周漢華教授鑒定為正品。

1．2溶液制備

1）對照品溶液的制備：精密稱取吳茱萸次堿、吳茱萸堿、檸檬苦素對照品適量，用100%甲醇溶解并稀釋制成0．662g／L、0．512g／L和0．204g／L的對照品儲備液。

2）樣品溶液的制備：取樣品粉末（過3號篩）約0．2g，精密稱定，置錐形瓶中，加入100%甲醇50mL，浸泡1h，超聲處理30min，放冷，搖勻，用微孔濾膜（0．22μm）濾過，備用。

1．3色譜與質譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（1．7 μm，100mm×2．1mm），柱溫40℃，樣品溫度10℃，流速0．4mL／min，進樣量2μL；以含0．05%甲酸的水（A）－乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

離子源為ESI源，正離子掃描模式，毛細管電壓3．0kV，取樣錐孔電壓30V，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量600L／h，錐孔氣流量50L／h。

1．4提取條件的選擇

分別以25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、90%甲醇、甲醇、乙醇、水作為提取溶劑，以微波提取、加熱回流提取、超聲提取作為提取方法，以30min、45min、60min、90min、120min作為提取時間，經UPLC－MS／MS檢測，把色譜峰數、峰面積、分離度、基線、峰形等因素作為指標，選擇最佳提取溶劑、提取方法和提取時間。經比較，最佳提取方案為以甲醇為提取溶劑、超聲波作為提取方法，提取時間30min。

1．5色譜和質譜條件優化

比較水－乙腈、0．05%甲酸水－乙腈、0．10%甲酸水－乙腈、0．20%甲酸水－乙腈、0．50%甲酸水－乙腈、1．00%甲酸水－乙腈、0．10%甲酸水－0．10%甲酸乙腈、水－甲醇、0．10%甲酸水－甲醇、0．10%甲酸水－0．10%甲酸甲醇等流動相系統的色譜峰峰形，以0．05%甲酸水－乙腈系統得到的色譜峰峰形較好且穩定。比較0．35mL／min、0．40mL／min、0．45mL／min、0．50mL／min的流速，以0．40mL／min的最佳；比較0．5μL、1．0μL、2．0μL、5．0μL的進樣量，以2．0μL的進樣量色譜峰峰形較好，各成分分離較好；比較100～1 000和200～800質荷比，以100～1 000范圍內色譜峰數相對較多，信息量豐富，響應值高。

2結果與分析

2．1方法學考察

精密度實驗試驗測得各共有峰相對保留時間RSD＜2．74%，相對峰面積RSD＜3．03%，表明進樣和儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術要求（RSD＜5．0%）。重復性試驗測得共有峰相對保留時間RSD＜3．12%，相對峰面積RSD＜2．24%，表明方法重復性良好，符合指紋圖譜的技術要求（RSD＜5．0%）。穩定性試驗測得各共有峰相對保留時間RSD＜2．62%，相對峰面積RSD＜3．23%，表明樣品溶液在24h內穩定性良好，符合指紋圖譜的技術要求（RSD＜5．0%）。

2．2指紋圖譜及標定

2．2．1指紋圖譜20批不同產地的吳茱萸藥材UPLC－MS／MS指紋圖譜見圖1，根據色譜峰中各色譜峰的相對保留時間，選取其中27個共有峰作為特征指紋峰，建立了吳茱萸樣品的對照指紋圖譜（圖2）。

2．2．2指紋圖譜的標定 比較20批供試品的色譜圖，確定27個共有峰，選擇保留時間適中且與相鄰色譜峰分離良好，峰面積比較穩定的吳茱萸堿（10號峰）作為參照峰，計算各指紋峰保留時間和峰面積與同一圖譜中參照峰的保留時間和峰面積比值，得到相對保留時間（表2）和相對峰面積（表3）。

2．3不同來源吳茱萸藥材相似度評價

從20批吳茱萸的相似度（表4）可知，各樣品與對照譜相比，其相似度均達0．9，表明藥材質量穩定，差異較小。

2．4聚類結果

聚類分析是根據相似程度大小把樣品分類，目前廣泛應用于中藥的真偽鑒別、質量評價、產地加工、品種分類等方面。對20個產地的吳茱萸藥材進行指紋圖譜分析，得到包括吳茱萸堿（10號峰）的27個共有色譜峰，將各個共有峰相對于參比峰的峰面積量化，得到20×27階數據矩陣，導入SPSS 16．0版軟件，采用組間連接法，選用歐氏距離對20批藥材進行聚類分析結果（圖3）表明，20個產地的吳茱萸藥材分為兩類，來自貴州銅仁、黔東南等產地的藥材即樣品S1～S9和S13～S15聚為第1類，說明這12個產地的吳茱萸藥材指紋圖譜較為相似；其他8個產地的藥材聚為第2類，即樣品S10～S12和S16～S20。吳茱萸和疏毛吳茱萸雖然品種不一，但具有一定的相似性；同為疏毛吳茱萸但存有一定差異性，可能與氣候條件、地質條件、栽培條件等方面有關。

圖1 吳茱萸20批樣品的指紋圖譜Fig．1 Fingerprint of 20 E．fructus samples

圖2 吳茱萸樣品的對照指紋圖譜Fig．2 CK fingerprints of E．fructus samples

2．5指紋圖譜共有峰的UPLC－MS結構鑒定及各成分

對27個共有峰中的11個主要峰的結構進行鑒定，其中3個色譜峰與對照品比較，通過對保留時間、一級質譜與二級質譜信息與對照品一致，鑒定為吳茱萸內酯（8號峰）、吳茱萸堿（10號峰）、吳茱萸次堿（11號峰）。其他結構成分見表5。

表2 吳茱萸藥材指紋圖譜共有峰相對保留時間Table 2 Relative retention time of common peaks in fingerprint of 20 Euodiae Fructus samples

表3 吳茱萸藥材指紋圖譜共有峰相對峰面積Table 3 Relative peak area of common peaks in fingerprint of 20 E．Fructus samples

表4 不同批次吳茱萸藥材樣品相似度Table 4 Similarity among 20 Euodiae Fructus samples

圖3 20批吳茱萸藥材的聚類樹狀圖Fig．3 Cluster analysis of 20 E．Fructus samples

表5 吳茱萸質譜數據和相關成分的化學鑒定Table 5 Mass spectrometric data and relative chemical components of E．Fructus

3結論與討論

試驗首次建立了黔產吳茱萸UPLC－MS／MS指紋圖譜，該圖譜信息量豐富、出峰數目多、分離效果好，全面反映了黔產吳茱萸化學成分的信息，符合中藥指紋圖譜的技術要求，結合相似度計算和聚類分析對指紋圖譜進行綜合評價，使得結果科學、可靠、準確、全面，為吳茱萸藥材的質量評價提供了參考。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［S］．北京：中國醫藥科技出版社，2010：160．

［2］康廷國．中藥鑒定學［M］．北京：中國中醫藥出版社，2005：316－317．

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［4］Hu C Q，Li K K，Yang X W．New glycosidic alkaloid from the nearly ripe fruits of Euodia rutaecarpa［J］．Journal of Asian Natural Products Research，2012，14（7）：634－639．

［5］Huang X，Zhang Y B，Yang X W．Indoloquinazoline alkaloids from Euodia rutaecarpa and their cytotoxic activities［J］．Journal of Asian Natural Products Research，2011，13（11）：977－983．

［6］王 群，劉 文，宋信莉，等．多指標優化吳茱萸的提取純化工藝［J］．中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）：45－48．

［7］張紅梅，李 國，宋 龍，等．貴州和浙江產吳茱萸指紋圖譜分析及含量測定［J］．中國實驗方劑學雜志，2014，20（17）：69－73．

［8］袁清照，張水寒，李順祥，等．吳茱萸道地藥材的高效液相指紋圖譜研究［J］．中草藥，2010，41（9）：1534－1538．

［9］趙 平，許海玉，許 浚，等．吳茱萸藥材的HPLC指紋圖譜研究［J］．中國中藥雜志，2010，35（23）：3178－3183．

［10］邱時祎．吳茱萸中生物堿的分離純化與質譜特征［D］．上海：華東理工大學，2012．

（責任編輯：聶克艷）

《貴州農業科學》常用法定計量單位及其符號

加工貯藏·農產品質量

Processing and Storage·Agricultural Product Quality

Fingerprint Analysis of Euodiae fructus by UPLC－MS／MS

ZHANG Jianfeng，LiIU Wen＊，WU Zengguang，ZHANG Shiyu，WANG Yule，YANG Daobin
（1．Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

The similarity of 20 E．fructus samples from different producing areas was evaluated by the evaluation system of fingerprint similarity in traditional Chinese medicine（2004A）under the test conditions of ACQUITY UPLC BEH C18chromatographic column（1．7μm，100mm×2．1mm），mobile phase of water with 0．05%methanoic acid（A）－acetonitrile（B）for gradient elution，40℃，0．4mL／min flow velocity and 2μL injection volume to provide the scientific basis for quality control，research，development and application of E．fructus．Results：The common model of E．fructus UPLC－MS／MS fingerprint is established and 27common peaks are determined．11common peaks are identified according to the reference substance and reference list．The similarity of 20 E．fructus samples from different producing areas is above 0．90．In conclusion，the PLC－MS／MS fingerprint analysis method with rapidity，high sensitivity and simplicity can be used in quality control of E．fructus medicinal materials．

Euodiae fructus；UPLC－MS／MS；fingerprint；quality control；clustering analysis

S567

A

1001－3601（2016）02－0084－0137－06

2015－08－05；2016－02－05修回

國家自然科學基金資助項目“基于‘譜效’關聯的戊己胃內漂浮釋藥系統制備工藝環節評價研究”（81460609）

張建鋒（1981－），男，在讀碩士，研究方向：中藥新技術與新制劑。E－mail：286911082＠qq．com

＊通訊作者：劉 文（1968－），男，教授，碩士生導師，從事中藥新技術與新制劑研究。E－mail：642771631＠qq．com