大鼠腦、肝組織3種RNA相對表達量與死亡時間的關系

董智杰，陳 亮，吳 岳△

(1.青海大學醫學院；2.青海省公安廳刑事技術研究管理中心)

大鼠腦、肝組織3種RNA相對表達量與死亡時間的關系

董智杰1，陳 亮2，吳 岳1△

(1.青海大學醫學院；2.青海省公安廳刑事技術研究管理中心)

目的 研究大鼠腦、肝臟組織3種RNA相對表達量與死亡時間的關系，比較兩組織用于死亡時間推斷的適用性。方法 將48只Wistar大鼠隨機分為6組，斷頸處死，分別于死后0、24、48、72、120、168 h取大鼠腦皮質及肝右外葉。提取腦、肝組織總RNA，采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)技術檢測兩組織中miR(腦特異性miR-124、肝特異性miR-122)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、β-肌動蛋白(β-actin)mRNA的循環閾值(cyclic threshold，Ct)。用BestKeeper程序篩選內參，對目的RNA的Ct值進行2-ΔΔCt轉換，用SPSS及GraphPad軟件對其進行單因素方差分析，并對ΔCt值進行曲線回歸分析。結果 miR-124和miR-122分別為腦、肝組織的內參。腦組織GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量在死后72 h內逐漸增加，并于死后72 h達到峰值，之后逐漸下降(P<0.05)；而肝GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量從死后48 h開始逐漸下降(P<0.05)。所有分子的最適回歸模型均為三次模型，且肝組織的相關系數r大于腦組織。結論 大鼠腦、肝組織中GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量與死亡時間具有相關性，肝組織比腦組織更適用于死亡時間推斷。

大鼠腦肝臟組織RNA表達量死亡時間

準確推斷死亡時間(postmortem interval，PMI)是刑事技術的一大挑戰，而傳統的PMI推斷方法易受外界環境因素、個體差異及檢驗者主觀因素和經驗的影響，準確性較差。近年來，研究者以分子生物學指標為研究對象，將核酸(DNA、RNA)的降解[1]情況應用于PMI推斷的研究中，但研究結果不一。本研究采用RT-qPCR技術檢測大鼠腦、肝臟組織miR(腦特異性miR-124、肝特異性miR-122)和GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量，并分析其與PMI的關系，進一步明確不同組織中不同RNA分子在PMI推斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與處理

健康成年雄性Wistar大鼠48只，體重(250±20)g，購于甘肅中醫藥大學實驗動物中心，許可證號SCXK(甘)2015-0002；于青海大學醫學院動物房適應性飼養7天(自由進食進水)。將大鼠隨機分為死后0、24、48、72、120、168 h六組，每組8只。將大鼠斷頸處死，置于溫度12±1 ℃、濕度40±2%的環境中，于死后相應時間點取大鼠腦皮質及肝右外葉，一部分組織凍存(-80℃)，一部分組織制片(4%多聚甲醛固定，HE染色)。

1.2 實驗試劑選擇

4%多聚甲醛(北京Solarbio公司)，無水乙醇、二甲苯(上海廣諾化學科技有限公司)，濃鹽酸、氨水、冰醋酸(西安三浦化學試劑有限公司)，蘇木素、伊紅(上海誠凜生物科技有限公司)，中性樹膠、50×TAE(北京biotopped公司)，氯仿、異丙醇(上海中泰化學試劑有限公司)，Trizol(美國Sigma公司)，GeneGreen核酸染料、RNase-Free H2O、5*RNA電泳Loading Buffer(北京TIANGEN公司)，BiowestAgarose(西班牙Biowest公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo公司)，gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)(日本Takara公司)。

1.3 實驗儀器選擇

Leica TP1020型全自動脫水機、Leica EG1150型石蠟包埋機、Leica EG1150C冷凍臺、Leica RM2126型輪轉式切片機、攤片機、Leica H1220型烘片機(德國Leica公司)，Thermo PrintMate150型組織盒書寫儀、NanoDrop 2000c核酸分析儀(美國Thermo公司)，OLYMPUS BX41型系統顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、IKAVortex Genius 3震蕩器(德國IKA集團)，SCILOGEXD1008E掌上離心機(美國SCILOGEX公司)，Eppendorf Centrifuge 5424 R離心機、EppendorfMastercyclerpro S梯度PCR儀(德國eppendorf公司)，F6/10 勻漿機(上海凈信科技)，ABI 7500RT-qPCR儀(美國ABI公司)，BIO-RAD GelDocXR+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4 實驗

1.4.1 總RNA提取

取50～100 mg腦或肝組織，加入1 mL Trizol，冰上勻漿，室溫放置10 min。加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min。4 ℃，12000×g離心15 min。取上層無色水相至新1.5 mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min。4 ℃，12000×g離心10 min，管底可見白色沉淀。棄上清，加入75%乙醇1 mL，渦旋混合，4 ℃，12000×g離心5 min。重復上一步驟，棄上清。在濾紙上倒置吸干，室溫干燥5 min。腦組織總RNA中加入90 μLRNase-Free H2O使其溶解，肝加入360 μL。用NanoDrop 2000 c核酸分析儀檢測RNA的濃度及純度、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。分裝后凍存(-80℃)。

1.4.2 引物合成

miR反轉錄采用莖環引物，miR-124：5＇-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA

CGACGGCATT-3＇，miR-122：5＇-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAA

CA-3＇。miR-124、miR-122及GAPDH、β-actinmRNART-qPCR的引物序列均引自參考文獻[2-5]，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，其序列見表1。

表1 各RNA指標RT-qPCR引物序列

1.4.3 gDNA去除與cDNA合成

用gDNA Eraser去除總RNA中的gDNA，反應體系10 μL：RNA 1 μg，gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，RNase-Free H2O補足至10 μL；反應條件：42 ℃ 2 min。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒對上述RNA進行反轉錄，反應體系20 μL：①RNA 1 μg，miR加入莖環引物2 μL(10 pmol/μL)，GAPDH、β-actin mRNA加入Oligo(dT)18 primer 1 μL，RNase-Free H2O補足至12 μL；反應條件：65 ℃ 5 min，冰上冷卻。②向上述12 μL體系中加入5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockRNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，10 mMdNTP Mix 2 μL，RevertAid M-MuLV RT(20 U/μL)1 μL；反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。將上述反轉錄cDNA按1：10稀釋，分裝后凍存(-20℃)。

1.4.4 RT-qPCR檢測

用SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒進行RT-qPCR反應，反應體系20 μL：SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free H2O 6 μL。用ABI 7500RT-qPCR儀進行擴增，擴增條件：①Stage 1：95 ℃ 30 s；②Stage 2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 Reps；③ Stage 3：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣本3個復孔。Ct值由7500 Software v2.0.6軟件測得。

1.5 統計學分析

運用BestKeeper程序篩選腦、肝臟組織的內參基因，將同一組織各候選基因的Ct值導入軟件，計算各基因標準差(SD)和變異系數(CV)的大小，其值越小，則該基因越穩定。因此，選取標準差和變異系數最小的RNA分子為內參基因。除內參外，以其余各RNA分子為目的基因，以大鼠死后0 h組為對照組，其余各組為處理組。將目的RNA分子的Ct值進行2-ΔΔCt[ΔΔCt=(Ct目的RNA-Ct內參)處理組-(Ct目的RNA-Ct內參)對照組]轉換，表示處理組各樣本的表達量相對于對照組的倍數，之后運用SPSS 21.0及GraphPad Prism 5軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。并對內參校正后的目的RNA分子的ΔCt(ΔCt=Ct目的RNA-Ct內參)與PMI進行曲線回歸分析。

2 結果

2.1 HE染色情況

組織大體改變：死后24、48 h時，腦、肝臟的形態未見明顯變化，之后組織變軟，色澤較晦暗。腦組織在死后72 h開始糊化，120 h及168 h時糊化加重，腦組織結構尚完整。

鏡下結果：死后不同時間腦和肝臟組織形態學變化分界不明顯。死后即刻，腦組織形態學變化較肝組織明顯，腦組織可見神經元腫脹及紅色神經元。各組腦、肝臟組織實質細胞均可見空泡形成，核固縮、碎裂、溶解。隨著死亡時間的延長，肝細胞染色質邊集逐漸明顯，死后168 h時，肝細胞結構不清，肝索排列紊亂，細胞核溶解消失，核數量明顯減少。見圖1～2。

A：0 h；B：24 h；C：48 h；D：72 h；E：120 h；F：168 h

A：0 h；B：24 h；C：48 h；D：72 h；E：120 h；F：168 h

2.2 RNA純度、濃度、完整性檢測及RT-qPCR結果

用NanoDrop 2000c核酸分析儀檢測總RNA的純度及濃度，測得所有樣本的OD260/280在1.8～2.1之間，表明RNA的純度良好。濃度在356 ng/μL～933 ng/μL之間。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3。表明腦組織總RNA在死后168 h內未見明顯降解，而肝組織總RNA在死后120 h開始明顯降解。

所有樣本的cDNA均進行了有效擴增，擴增曲線良好，均得到Ct值。溶解曲線均為單峰，表明無引物二聚體及非特異性擴增。

圖3 腦(左)和肝(右)組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 內參基因篩選結果

運用BestKeeper程序篩選腦、肝臟的內參基因，結果見表2。表2顯示，腦組織中miR-124的標準差和變異系數最小，肝組織中miR-122的標準差和變異系數最小。因此，將miR-124作為腦的內參基因、miR-122作為肝的內參基因。對兩組織中的GAPDH、β-actin mRNA的Ct值進行內參校正，得到ΔCt值。

表2 腦和肝組織3種候選內參基因表達穩定性結果(Ct值)

2.4 各RNA的相對表達量2-ΔΔCt與PMI的單因素方差分析結果

大鼠死后不同時間腦和肝臟組織各RNA的相對表達量2-ΔΔCt的組間差異性比較結果見表3。大鼠腦組織GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量在死后72 h內逐漸增加，并于死后72 h達到峰值，之后逐漸下降(P<0.05)；而肝GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量從死后48 h開始逐漸下降(P<0.05)。其變化趨勢見圖4。

表3 死后不同時間各RNA的相對表達量

*：與同組織該分子0 h組相比P<0.05；△：與同組織該分子72 h組相比P<0.05.

圖4 腦(左)和肝(右)組織各RNA相對表達量隨PMI的變化趨勢圖

2.5 各RNA的ΔCt值與PMI的曲線回歸分析結果

對腦和肝組織的GAPDH、β-actin mRNA的ΔCt值進行統計分析，以PMI為自變量x、ΔCt值為因變量y進行曲線回歸分析，構建一次、二次和三次模型，結果見表4，曲線圖見圖5。以腦GAPDH mRNA為例(見表4)，相關系數r三次(0.659)>r二次(0.645)>r一次(0.310)，且三個模型P<0.05。因此，三次模型可作為腦GAPDH mRNA的最適模型。同理，腦β-actin mRNA及肝GAPDH、β-actin mRNA的最適模型均為三次模型。腦組織與肝組織相比，腦組織兩RNA最適模型的相關系數r介于0.4～0.7之間，為中度相關，而肝組織的大于0.7，為高度相關。因此，肝組織比腦組織更適用于PMI推斷。

表4 各RNA的ΔCt值與PMI的回歸模型

注：#為RNA指標的最適模型.

圖5 腦(A、B)和肝(C、D)組織GAPDH(A、C)、β-actin(B、D)mRNA的ΔCt值與PMI的回歸曲線圖

3 討論

本研究結果顯示，大鼠神經元與肝細胞形態隨PMI發生變化，且大鼠腦和肝組織中GAPDH、β-actin mRNA的相對表達量與PMI具有相關性，肝臟比腦組織更適用于PMI推斷。

大鼠死后，各組織缺血缺氧，膜穩定性下降，溶酶體膜破裂，釋放出各種水解酶，使核酸、蛋白質等物質逐漸降解，表現為核固縮、碎裂、溶解，隨著PMI的延長，自溶加重，表現為細胞形態結構不清直至消失。由于腦組織對缺氧更敏感，因此死后即刻神經元的形態學變化較肝細胞更為明顯。由于死后各組織缺血缺氧，導致細胞氧化磷酸化過程受阻，使ATP的合成減少，Na+-K+-ATP酶的功能下降，導致細胞內水、鈉潴留，表現為細胞腫脹。

近年來，RNA的穩定性[6]得到證實，通過RNA的降解情況尤其是定量檢測RNA的相對表達量推斷PMI成為研究的熱點。本研究通過RT-qPCR技術定量檢測大鼠死后不同時間腦和肝組織3種RNA的相對表達量來推斷PMI，不像普通RT-PCR技術只能在擴增結束后進行粗略定量(分析擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖像)，而RT-qPCR技術可實時監測擴增全程，通過在DNA雙鏈間嵌入熒光基團增加熒光信號強度，進而監測模板的表達量，更方便、準確。RT-qPCR技術具有靈敏、快速、高效等優點[7]，但其結果的準確性依賴于內參的正確選擇和較小的操作誤差。本研究應用BestKeeper程序，通過計算各分子的標準差和變異系數，以最小者作為內參，并非在實驗前默認某個分子作為內參，有效避免了因實驗處理因素導致的內參表達量的變化而引起的誤差；同時對每個樣本做3個復孔以減少人為操作誤差。本研究中腦和肝臟組織均選取3個候選內參基因，miR在兩組織中表達最為穩定，說明其受PMI的影響較小，與Lv等[8-9]研究結果一致。miR的表達具有保守性和組織特異性，miR-124和miR-122分別在腦和肝臟組織中特異性高表達，可有效減少個體差異引起的誤差；且其僅含有22個左右核苷酸，片段小，穩定性強，這些因素決定了miR為較理想的內參，可提高實驗結果的準確性。本實驗中miR在反轉錄的過程中采用莖環引物而非線性引物，莖環引物特異性高，可以區分miR前體及僅有個別堿基差異的miR分子[10]。

本研究選取管家基因GAPDH和β-actin推斷PMI，因為管家基因是維持細胞基本生命活動所必需的基因，在所有組織細胞中高豐度且恒定表達，可減少個體差異造成的誤差。GAPDH是糖酵解過程中的酶，在缺氧條件下，機體通過上調GAPDH的表達量增加對葡萄糖的利用，以增加機體的能量供應。機體死后一段時間，各組織細胞殘存部分活性，尚能感受機體缺氧狀態，此時GAPDH的增加速率大于降解速率。因此，GAPDH mRNA的相對表達量在死后一段時間內升高；隨著PMI的延長，糖酵解過程逐漸減弱，GAPDH的增加速率小于降解速率，表現為下降。腦組織處于相對封閉的環境中，有顱骨作為天然屏障，受外界因素影響較小[11]，因此腦組織GAPDH mRNA的相對表達量表現為先升高后下降；而肝臟位于腹腔中，與腸管相鄰，所處環境含有大量細菌，且肝臟本身含有大量的酶，均加速GAPDH mRNA的降解，因此肝臟中降解速率大于腦組織，肝臟GAPDH mRNA沒有出現升高而是逐漸下降。β-actin參與構成細胞骨架，是微絲的組成成分，在缺氧條件下，細胞骨架結構可能遭到破壞或成分發生改變，使其相對表達量升高；β-actinmRNA在腦組織和肝臟中的變化原因同GAPDH。

本實驗研究結果與Lv[5]、Pan[12]、呂葉輝[13]等不同，可能與死因、環境、組織類型等有關。在后續研究中應添加動物及人體驗證模型，以檢驗實驗結果的準確性。目前，用RNA的相對表對量推斷PMI仍處于理論研究階段，如何將理論研究結果應用于法醫實踐將是未來研究的重點。

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Relationship among relative expression levels of 3 kinds of RNA and postmortem intervalin brain and livertissues of rats

DONG Zhi-jie1，CHEN Liang2，WU Yue1

(1.Qinghai University Medical College；2.Department of Criminal Technology Research and Management Center，Qinghai Provincial Public Security)

Objective To study the relationship between the relative expression levels of 3 kinds of RNA and postmortem intervalin two different tissues of brain and liver in rats，and to compare the applicability of the two tissues in the estimation of PMI.Methods 48 Wistar rats were randomly divided into 6 groups，and all of them were killed by neck dislocation.Atthe postmortem 0 h，24 h，48 h，72 h，120 h，168 h，cerebral cortex and right hepatic lobe were taken.Thentotal RNA of brain and liver tissues were extracted，and the cyclic thresholds(Ct values)of miR(brain specific miR-124，liver specific miR-122)and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)，beta -actin(β-actin)mRNA in the two tissues were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR).Theinternal reference was selected by BestKeeper program，and the Ct value of target RNA was converted into 2-ΔΔCt.Single factor variance analysis was used to examine 2-ΔΔCtby SPSS and GraphPad software，and the curve regression analysis was used to examine ΔCtvalue.Results MiR-124 and miR-122 were the most suitable internal reference in brain and liver tissues respectively.The relative expression levels of brain tissue GAPDH and β-actin mRNA increased gradually within the postmortem72 h，and the peak was reached at the postmortem 72 h，after the postmortem 72 h the relative expression levels decreased gradually(P< 0.05).The relative expression levels of hepatic GAPDH and β-actin mRNA decreased gradually after the postmortem 48h(P<0.05).The optimal regression models of all RNA were the cubic model.The correlation coefficient of liver tissue was larger than that of the brain tissue.Conclusion The relative expression levels of GAPDH and β-actin mRNA in brain and liver tissues of rats are correlated with PMI.The liver tissue is more suitable forthe estimation of PMI than the brain tissue.

rats brain liver tissue RNA expression level postmortem interval

R89

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.008

2016-06-12

※：董智杰(1990～)，女，漢族，河南籍，青海大學醫學院2014級碩士研究生.△：通信作者，碩士生導師，E-mail：1577697749@qq.com