腦、心臟、肝臟細胞核DNA與西寧地區早期死亡時間

郭長智，吳 岳

(青海大學醫學院，西寧 810001)

腦、心臟、肝臟細胞核DNA與西寧地區早期死亡時間

郭長智，吳 岳△

(青海大學醫學院，西寧 810001)

目的 研究西寧地區大鼠腦、心臟和肝臟細胞核DNA的降解與死亡時間關系，為該地區推斷早期死亡時間尋找新的指標。方法 將40只大鼠隨機分為0、2、4、8、12、24、48、72 h八個組，斷頸處死后取腦皮質、心尖、肝臟組織經福爾馬林固定后用改良Feulgen染色法染色，用計算機圖像分析軟件測量染色圖像的AOD、IOD、A、MD、PI及周長，分析死亡時間與各參數的關系。結果 隨死亡時間的延長，腦皮質、心尖、肝臟組織內AOD、IOD、A、MD及周長均呈現下降趨勢，PI呈上升趨勢。腦和肝臟DNA死后降解較心臟快。腦、心臟及肝臟DNA各參數與死亡時間均有相關性，灰度參數中的IOD與死亡時間的相關性較AOD高，形態參數中的異形指數(PI)與死亡時間相關性較其余三個參數好。結論 大鼠腦、心臟及肝臟細胞核DNA含量變化可推斷西寧地區早期死亡時間，相關指標數值具有地域性。

死亡時間 DNA IAT

早期死亡時間(Postmortem interval，PMI，也稱死后間隔時間)推斷一直是法醫病理學研究的重點及難點之一。傳統上利用尸僵、尸溫等推斷死亡時間易受法醫的主觀經驗影響。隨著研究水平的不斷深入，研究者從分子水平利用計算機圖像分析軟件檢測細胞核DNA含量的變化，通過DNA含量更加精確地推斷出死亡時間。但法醫工作者在實踐中發現，腦、心臟及肝臟細胞核DNA含量變化雖可推斷早期死亡時間，但其相關指標數值在不同地區存在差異性。本研究擬對此做相關研究，考察西寧地區腦、心臟和肝臟細胞核DNA的降解與死亡時間關系的地域性特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康SD大鼠40只，雌雄不限，體重(220±12)g(由青海省地方病研究防治所提供，動物合格證號：2014001)，適應性飼養3 d。斷頸處死大鼠，依據隨機原則將其分為死后0、2、4、8、12、24、48、72 h八個組，每組5只，以死后0 h組為對照組，死后即刻以平均手術時間5 min計算。尸體保存于室內環境中，環境溫度(19～21)℃、濕度(20～31)%。

1.2 實驗試劑

甲醛、1%鹽酸酒精、無水乙醇(天津市紅巖化學試劑廠)；二甲苯 (津市化學試劑一廠)；石蠟、中性樹膠(上海標本模型廠)；Schiff Reagent、偏亞硫酸溶液、弱酸溶液、SO2溶液 (LEAGENE公司)；蘇木素、伊紅(武漢博士德公司)。

1.3 實驗儀器

石蠟載玻片、蓋玻片(上海標本模型廠)；SPRING-R10型純水機(西安華浦)；石蠟切片機(LEICA 公司)；FA1104電子天平(上海臺鈺電子有限公司)；熒光+普通光學顯微鏡(ZEISS Axipskop)；MH-2800D型多用恒溫箱(上海正慧工貿有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織取材

取(0.5×0.5×0.5)cm的腦皮質、心尖、肝臟最大葉，固定于中性福爾馬林中。

1.4.2 HE法染色

固定的組織行常規HE染色。

1.4.3 Feulgen-Vans改良法染色

石蠟切片脫蠟至水；鹽酸液(1mol/L)水解(60℃，470s)；無色Schiff試劑室溫浸染(2400s)；偏亞硫酸鈉液洗2次，每次60 s；自來水洗180 s(切片呈紫紅色)，用無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4.4 計算機圖像分析

采用Image-pro Plus軟件對染色后的切片進行DNA定量分析。圖像中呈現紫紅色的DNA染色區域作為AOI(area of interest)行光密度分析，選陽性面積(Area，A)、平均直徑(Mean Diameter，MD)、異形指數(Positive Index，PI)、積分光密度(Integral Optical Density，IOD)、平均光密度(Average Optical Density，AOD)及周長等能較好代表DNA含量的6個指標進行測量分析，獲得相關數據。每張切片在400倍光鏡下，沿弓字形隨機選取5個視野，不經過鹽酸水解的切片作陰性對照。由顯微鏡自帶相機拍照存入計算機內。

1.5 統計學方法

統計分析采用 SPSS19.0 軟件，組間比較采用方差分析；DNA含量與死亡時間做相關回歸分析；檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 HE染色

組織大體觀察：組織器官變軟，色澤異于正常，組織結構不清。

鏡下：以死后0 h腦、心、肝組織細胞形態為對照，對比觀察死后各時間組的組織細胞形態。各時間組間無明確的形態學分界，可見各細胞逐漸出現自溶現象。腦、心、肝組織細胞形態變化中，心臟自溶速率相對較慢，腦自溶相對較快。組織結構模糊，細胞腫脹；嗜堿性減弱，嗜酸性增強；心肌的橫紋、神經元細胞的尼氏體消失；核染色質凝聚、碎裂、溶解、消失；死后72 h組織結構模糊不清。見圖1～3。

2.2 Feulgen染色

0 h肝細胞核呈紫紅色、圓形，可見核仁，可見雙核細胞；腦細胞核呈紫紅色、圓形、梭形，可見尼氏體、核仁；心肌細胞核呈紫紅色、長橢圓形、柱形，可見核仁；間質細胞呈深紫紅、梭形。隨著死亡時間的不斷推移，核凝聚、碎裂、溶解、消失。見圖4～6。

2.3 計算機圖像分析

隨著死亡時間的推移，細胞核DNA相關參數(幾何參數與灰度參數)變化呈現一定規律，除異形指數(PI)隨著死亡時間增加呈上升趨勢，其他五個參數[IOD、平均光密度(AOD)，面積(A)和等效直徑(MD) 及周長]均隨著死亡時間推移呈下降趨勢。與前一時間組比較，各組間均有差異，且差異有統計學意義(P<0.05)。見表1～3。各組織細胞中DNA參數隨死亡時間變化均有差異，且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7～12。

A：0 h； B：24 h； C：48 h； D：72 h A：0 h； B：24 h； C：48 h； D：72 h

圖1 不同時間肝臟呈現圖(HE，×400) 圖2 不同時間腦呈現圖(HE，×400)

Figure 1 Liver tissue by different PMI(HE，×400) Figure 2 Brain tissue by different PMI(HE，×400)

A：0 h； B：24 h； C：48 h； D：72 h A：0 h； B：24 h； C：48 h； D：72 h

A：0 h； B：24 h； C：48 h； D：72 h A：0 h； B：24 h； C：48 h； D：72 h

圖5 不同時間腦呈現圖(Feulgen，×400) 圖6 不同時間心臟呈現圖(Feulgen，×400)

Figure 5 Brain tissue by different PMI(Feulgen，×400) Figure 6 Heart tissue by different PMI(Feulgen，×400)

Table 1 Results of CIAS of brain tissue by modified Feulgen stain

*：與前一組比較P<0.05；**：與前一組比較：P<0.01.

Table 2 Results of CIAS of liver tissue by modified Feulgen stain

*：與前一組比較P<0.05；**：與前一組比較：P<0.01.

Table 3 Results of CIAS of heart tissue by modified Feulgen stain

*：與前一組比較P<0.05；**：與前一組比較：P<0.01.

死亡時間(h) 死亡時間(h)

死亡時間(h) 死亡時間(h)

死亡時間(h) 死亡時間(h)

2.4 不同組織DNA各參數與死亡時間的相關性分析

腦、心臟及肝臟DNA各參數與死亡時間均有相關性，其中灰度參數中的IOD與死亡時間的相關性較AOD高，形態參數中的異形指數(PI)與死亡時間相關性較其余三個參數好。見表4。

表4 不同臟器細胞DNA含量與死亡時間的相關系數

Table 4 Correlations between PMI and DNA in different tissues

2.5 不同組織各參數與死亡時間的回歸分析

腦的細胞核IOD與周長隨時間的變化在肝臟與心臟兩組存在差異，其變化較其他組織快(斜率較大)，肝臟次之，心臟最慢；腦的細胞核AOD隨時間變化在肝臟與心臟兩組存在差異，其變化最快，心臟次之，肝臟最慢；肝臟的A與M在腦與心臟兩組存在差異，其變化最快，腦次之，心臟最慢；但腦與心臟的PI隨時間變化趨勢與規律相同，均快于肝臟。

表5 不同臟器細胞DNA含量(X)與死亡時間(Y)的回歸方程

Table 5 Regression equations between PMI(Y)and DNA content(X)in different tissues

3 討論

本研究顯示，大鼠腦、心臟及肝臟細胞核DNA含量變化可推斷西寧地區早期死亡時間，相關指標數值具有地域性。

細胞核中的DNA作為生物的遺傳物質，其結構、功能具有相對穩定性；同一物種間不同個體中不同組織的體細胞核DNA平均含量具有恒定性[1，2]。機體死亡后組織發生缺血、缺氧、線粒體氧化磷酸化過程障礙，ATP合成減少，致使胞膜鈉泵功能降低、衰竭，細胞內水分增加。同時細胞中ATP含量降低使細胞膜鈣離子泵功能減弱，從而導致細胞內Ca2+濃度升高，促使蛋白酶、磷脂酶及ATP酶、DNA內切酶等活化。同時，細胞內ATP減少而AMP增多使磷酸果糖激酶活性增加，促使糖酵解增強和細胞內乳酸、無機磷含量增多，最終引起細胞內PH降低。此外，死后一段時間內細胞尚存部分生活反應，增多的氧自由基可對細胞膜進行性降解，使細胞骨架系統遭受破壞。各種損傷因素均可破壞細胞的穩態，使胞漿內溶酶體酶釋放并被活化，致使細胞發生自身消化、結構解體，表現為自溶的過程[3]。降解過程中細胞核的形態及DNA的含量變化具有規律性及穩定性[4]，表現為細胞核核凝聚、碎裂、溶解、消失；細胞核DNA從雙鏈降解為單鏈，隨后變為小分子片段，減少直至消失。

早在1971年Adler和Beckhore[5]用結合化學方法和分光光度計測量心臟細胞核DNA含量進行死亡時間研究，發現DNA含量與死亡時間存在一定關系。隨后研究者利用不同的方法[6-12]證實DNA與死亡時間存在關系，細胞核DNA隨死亡時間的延長逐漸降解，其含量變化與死亡時間呈線性相關。雖各國學者采用不同方法來探討死后DNA含量變化規律，均認為組織細胞核內DNA含量隨死亡時間有規律地下降，直至消失。

目前DNA定量分析的方法主要有兩種，一是流式細胞儀(FCM)法，二是組化定量分析技術、計算機圖像分析(CIAS)與顯微分光光度計(MSP)法。FCM法具有快速、靈活、準確、靈敏等特點，但操作處理樣品時會對細胞DNA造成物理損傷，可使部分細胞提前自溶、DNA提前被降解。MSP法對光源要求高，操作時稍有不慎就會導致系統誤差的產生，同時該樣品處理時要求物質的分布密度適中且均勻、大小適中，這限制了在該技術在法醫實踐中的應用[13]。計算機圖像分析技術法首先要進行細胞學涂片、組織切片，經Feulgen改良法染色，然后利用計算機圖像分析系統對圖像信息收集、處理、測量、計算與分析，得出圖像的數量變化；由于計算機圖像分析系統法使用方便，只需涂片或切片后經染色后利用計算機系統就可得出數據，同時此方法具有客觀性強、重復性好、自動化程度高等特點；且隨著計算機性能的不斷完善、檢測系統的不斷優化，促使計算機圖像分析技術推測死亡時間在理論及技術上的可行性和推廣性有了良好的保證[13]。

以往DNA與死亡時間關系的研究大多將冷藏尸體[14]、離體組織[15]作為實驗材料，即使是將同一組動物或人作為研究對象的在體研究[16]，同一部位多次重復取材會影響該組織原有的自溶過程；同時環境是影響細胞核DNA降解的主要因素[17]，國內以往相關研究是在平原地區進行，西寧所處的特殊地理位置決定了其特有的環境。基于此建立死亡模型，即選擇體重相近的SD大鼠為研究對象；每個死亡時間點對應一組大鼠，且該大鼠身體是完整的，未被取材；組織的取材部位盡可能一致；大鼠處死后放置室內。

對腦、心、肝、脾臟、牙髓等細胞核DNA降解研究[16，18]發現，腦、心臟、肝臟適合早期死亡時間的推斷，故本次實驗選擇此種組織作為研究對象。光鏡下觀察三種組織HE染色片子，顯示隨著死亡時間的不斷推移，組織自溶程度不斷加重，組織細胞特有的結構消失，核染色質核凝聚、碎裂、溶解、消失，三種組織的自溶速率有差異，其中腦組織最快，肝臟次之，心臟最慢。腦死亡后24 h明顯自溶，細胞核膜破裂，組織結構模糊。肝臟在48 h出現明顯自溶，心臟則在72 h。以上實驗結果可認為組織的自溶程度與死亡時間和臟器有關，與前人研究結果相一致。

通過觀察腦、心臟和肝臟等三個組織的改良Feulgen染色切片，發現三種組織大部分的細胞核在死后48 h核仁消失，出現部分細胞核溶解、核固縮；72 h細胞核著色明顯變淺，提示細胞核DNA含量隨死亡時間的推移其變化呈現出一定規律。此外發現，腦細胞核的染色變化較心肌、肝臟明顯，提示腦組織DNA降解較心臟和肝臟快。計算機圖像分析顯示腦、心臟、肝臟等三組織DNA的IOD、AOD、A、MD、PI及周長等六個參數隨死亡時間延長，IOD、AOD、A、MD及周長等5個指標在死后各時間點依次呈下降趨勢(P<0.05)；PI隨著死后時間推移，呈上升趨勢(P<0.05)。計算機圖像分析顯示腦、心臟、肝臟等三組織DNA的六個參數與死亡時間均存在線性相關。其中灰度參數中的IOD與死亡時間相關性較AOD好，形態參數中的PI與死亡時間相關性較其余三個參數好，提示IOD及PI可作為利用Fulgen染色和計算機圖像分析軟件研究DNA與死亡時間關系的指標。同時研究發現西寧地區DNA降解較同等溫度下其他地區慢，這可能與本研究環境中的低濕、低氧等有關。造成DNA降解的原因有水解作用、氧化作用及微生物分解作用，而濕度主要是通過水解作用和氧化作用影響DNA降解；水解反應中的空氣中的H2O分子直接加速DNA降解；氧化反應中空氣中的水分子是DNA氧化反應的中間介導物，水分子的存在促使O2-生成，從而加速了DNA氧化反應[19]。本實驗的環境濕度在(20-31)%，屬低濕環境。低濕可減緩DNA降解。本實驗在西寧進行，地處青藏高原，氧含量較平原低，低氧可減緩DNA的氧化反應速率。

[1]Kono Y，Ozawa K，Tanaka J，et al.Significance of mitochondrial enhancement in restoring hepatic energy charge after revascularization of isolated ischemic liver[J].Trans-plantation，1982，33(2)：150-155.

[2]Schulte EKW.Standardization of Feulgen reason for absorption DNA imag-e cytomctry：a review[J].Anual cell pathol，1991，3：167-182.

[3]趙字琴，廖志剛，王英元，等.法醫病理學[M].北京：人民衛生出版社，2009，71

[4]劉良，楊天，潼任亮.死亡時間——當今中國法醫病理學研究的熱點及難點[J].Evi-dence Science.2008，16(2)：234-241.

[5]Adler CP，Beckhove P.Postmortem DNA changes in heart muscle[J].BeitrPathol，1971，142(3)：306-320.

[6]Avtandilov GG，Viter VI，Gordan ES.Dynamics of the nuclear DNA content in the liver，skeletal muscles and myocardium of the rat in the postmortem period：a microspectrophotometric study[J].Biull Eksp Biol Med，1979，87(6)：620-622.

[7]熊平，郭萍，張靜.組織細胞DNA降解與死亡時間的相關性的顯微拉曼光譜分析[J].光譜學與光譜分析，2010，30(6)：1151-1155.

[8]賈永蕊.流式細胞術在DNA檢測中的應用[J].中國醫學裝備，2010，7(4)：4-6.

[9]Nunno.NR.D，Costantinides F，Bernasconi P，et al.IS flow cytometric evaluation of DNA degradation a reliable method to investigate the early postmortem period Am[J].Forensic Med Pathol，1998，19(1)：50-53.

[10]Shu X，Liu Y，Ren L，et al.Correlative analysis on the relation between PMI and DNA degradation of cell nucleus in human different tissue[J].J Huazhong Univ Sci Tecnolog Med Sci，2005，25(4)：423-426.

[11]Petito CK，Roberts B.Effect of postmortem interval onin situ endlabeling of DNA oligonucleosomes[J].J Neuropathol Exp Neurol，1995，54(6)：761-765.

[12]易少華，趙小紅，劉良.彗星試驗檢測死后DNA降解推斷PMI的參數選擇研究[J].中國法醫學雜志.2008，23(1)：1-4.

[13]王誠毅，劉良.圖像分析技術定量含量變化推斷死亡時間的研究及應用前景.法醫學雜志[J]，2002，18(1)：56-59.

[14]Di Nunno NR，Costantinides F，Bemasconi P，et a1．Is flow cytometric evaluation of DNA degradation a reliable method to investigate the early postmortem period[J].Am J Forensic Med Pathol，1998，19(1)：50-53.

[15]Laura A，Johnson，James A，et a1.Analysis ofpostmortem DNA degradation by single-cell gel electrophoresis[J]．Forensic Sci.Int，2002，12(6)：43-45.

[16]劉良財，崔玉寶.不同器官組織細胞中DNA含量與死亡時間推斷的研究進展[J].四川解剖學雜志.2012，20(04)：55-57.

[17]李姍姍，趙春明，劉泉.利用不同溫度下人肝細胞DNA降解參數推斷早期PMI[J].2011，26(1)：4-6.

[18]Boy SC，Bernitz H，Van Heerden WF.Flow cytometric evaluation of postmortem pulp DNA degradation[J].Am J Forensic Med Pathol，2003，24(2)：123-127.

[19]楊周岐，張虎勤，張金，等.古人類骨骼DNA降解影響因素分析[J].第四軍醫大學學報，2006，27(1)：90-92.

Study on postmortem interval and nuclei DNA of brain，heart and liver in rats

Guo Changzhi，Wu Yue△

(Qinghai Uiniversity Medical College)

Objective To investigate the relationship between postmortem interval and nuclei DNA in brain，heart and liver in rats at Xining area to find new parameters determine the postmortem interval.Methods Rats were randomized into 8 groups：0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，48 h and 72 h group.Then the Rats were killed by neck dislocation and the brain，heart and liver were taken，fixed in formalin，stained with Feulgen，and then analyzed by Image analysis technology(IAT).The relationship between PMI and DNA was analyzed by measuring AOD，IOD，A，MD，Perimeter and PI.Results AOD，IOD，A，MD，Perimeter in liver，heart and brain decreased by the time going，but the PI showed a rising trend.The DNA of brain and liver degraded faster than heart.The relationship between PMI and IOD，PI were closer than other parameters.Conclusion DNA in brain，liver，heart may be the new parameters for estimating early PMI by Image analysis technology，and the parameters are different among regions.

Postmortem interval DNA IAT

R89

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.006

2015-10-12

郭長智(1990～)，女，漢族，甘肅籍，2013 級碩士研究生．△：：通訊作者，副教授，E-mail：1577697749@qq.com