全血法流式細胞術檢測中性粒細胞抗體方法建立及臨床初步應用

王 璇 朱晴暉

全血法流式細胞術檢測中性粒細胞抗體方法建立及臨床初步應用

王 璇 朱晴暉

目的 建立適用于臨床的流式細胞術檢測中性粒細胞（PMN）抗體的方法，確定健康人PMN CD16b和CD177兩種抗原的參考范圍，并初步用于檢測抗PMN抗體。方法 應用流式細胞術，以前向散射和側向散射參數區分全血標本中的淋巴細胞和粒細胞，設定粒細胞門，用CD16b-PE和CD177-APC單克隆抗體分別檢測中性粒細胞表面表達CD16b和CD177抗原的細胞的百分率，以此作為判斷檢測對象血液中抗CD16b或CD177抗體存在與否的依據。結果 分別確定了健康人群PMN表達CD16b和CD177的參考范圍（＞x--2s）。心腦血管疾病患者3例中CD16b和CD177抗體均陽性者2例，淋巴瘤患者1例CD16b和CD177抗體均陽性，1例巨幼細胞性貧血患者檢出CD16b抗體陽性，慢性PMN減少癥患者6例中CD16b抗體陽性1例、CD16b和CD177抗體均陽性1例；自身免疫性疾病患者4例、甲狀腺功能亢進、貧血患者和化療后PMN減少的白血病患者各1例均未檢出CD16b或CD177抗體陽性。結論 流式細胞術檢測抗中性粒細胞CD16b和CD177抗體的簡便快捷，適用于自身免疫性中性粒細胞減少癥的實驗診斷和鑒別診斷。

自身免疫性中性粒細胞減少癥；中性粒細胞抗體；流式細胞術

自身免疫性中性粒細胞減少癥（autoimmune neutropenia，AIN），是一組由中性粒細胞抗體介導的粒細胞減少（＜10歲兒童外周血中性粒細胞絕對值低于1.5×109/L，成人＜2.0×109/L）和粒細胞缺乏（粒細胞絕對值＜0.5×109/L）［1］。因患者體內存在中性粒細胞特異性抗原的抗體，導致中性粒細胞（PMN）在外周血或通過脾臟的時候破壞，或由補體介導的PMN溶解作用使粒細胞減少。

PMN表面有多種抗原，目前已發現的有HNA-1a、HNA-1b、HNA-1c、HNA-2a、HNA-2b、HNA-3a、HNA-4a和HNA-5a。在CD系統的命名中HNA-1即為CD16b，HNA-2a即為CD177，HNA-4a為 CD11a，HNA-5a為 CD11b。CD16b、CD11b、CD177是自身抗體結合位點，其中以抗HNA-1即抗CD16b的抗體為最多，約占30%［2］，因而本實驗選擇CD16b和CD177作為靶抗原。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

試劑：單克隆抗體：PE標記小鼠抗人CD16b（IgG2aκ），克隆號（CLB-gran 11.5）。APC標記小鼠抗人CD177（IgG1），克隆號（MEM-166）。以上抗體分別產自BD公司（USA）和Abcam公司（Hongkong）。溶血劑（Lysing Solution）和緩沖液（FASC Flow）都產自BD公司。

主要儀器：流式細胞儀：型號FACS Calibur，美國Becton-Dickinson公司產品。

1.2 標本來源

健康對照組：參加健康體檢人員24例（男14例，女10例），WBC總數在5.9×109/L～9.9×109/L，中性粒細胞百分率在53%～68.7%，年齡21～56歲。

患者18例：年齡43～79歲（男5例，女13例），其中心腦血管疾病患者3例，淋巴瘤患者1例，慢性PMN減少患者6例，巨幼細胞性貧血1例，自身免疫性疾病（類風濕關節炎、皮肌炎、SLE）患者4例，甲狀腺功能亢進、貧血和化療后PMN減少的白血病患者各1例。

1.3 方法

1.3.1 檢測過程 以EDTA-K2抗凝全血1 ml為標本，離心去血漿待用，并準備2支Falcon管：1號管為空白對照，不加任何抗體；2號管中加入PE標記的CD16b抗體10 μl，APC標記的CD177抗體5 μl，在兩管中加入去漿血50 μl，輕混勻，室溫避光靜置20 min。加入溶血素1 ml，混勻，避光靜置10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清并加入PBS 1 ml，混勻，1 500 r/min離心5min，棄上清再加入PBS 300 μl重懸浮，上流式細胞儀檢測。以前向散射與側向散射參數區分淋巴細胞和粒細胞，確立粒細胞門，檢測PMN表面表達CD16b和CD177的百分率。

1.3.2 參考范圍 CD16b為＞（x--2s），CD177為＞（x--2s）。

1.3.3 結果比對 用該方法檢測自體免疫性疾病伴或不伴PMN減少患者，以及非自身免疫性疾病患者共18例的全血標本中的PMN表面CD16b表達和CD177的表達百分率，與參考范圍比較，以此判斷患者血液中抗CD16b和CD177抗體存在與否。

2 結果

2.1 健康對照中性粒細胞表達CD16b和CD177的百分率

24例健康對照PMN表達CD16b和CD177的百分率的原始數據見表1。健康人流式細胞儀檢測結果見圖1。

圖1 FCM測定健康人CD16b和CD177抗原散點圖

2.2 臨床患者檢測結果

2.2.1 其他疾病中檢測結果 心腦血管疾病患者3例中CD16b和CD177抗體均陽性者2例，淋巴瘤患者1例CD16b和CD177抗體均陽性（圖2），1例有輸血史的巨幼細胞性貧血患者檢出CD16b抗體陽性，甲狀腺功能亢進、貧血和化療后PMN減少的白血病患者各1例均未檢出CD16b或CD177抗體。

圖2 FCM測定CD177抗原低百分率散點圖

2.2.2 自身免疫性疾病中檢測結果 4例自身免疫性疾病患者抗體均為陰性(注：自身免疫性疾病與其他疾病兩組患者PMN數均在正常范圍）。

2.2.3 慢性PMN減少癥檢測及治療結果 6例慢性PMN減少癥患者中檢出CD16b抗體陽性1例（圖3），檢出CD16b和CD177抗體均陽性1例，該患者經激素治療2周后，其WBC從3.5×109/L升 至4.3×109/L，PMN從2.16×109/L升 至3.0×109/ L，PMN表達CD16b和CD177抗原的百分率分別從93.85%和 42.65%，升至98.87%（在參考范圍內）和47.7%。

圖3 FCM測定CD16b抗原低百分率散點圖注：提示該患者CD16b抗體陽性

3 討論

在AIN的診斷上除明確規定了中性粒細胞減少的標準輔以骨髓檢查外，主要采取的是除外診斷，缺乏自身免疫性中性粒細胞減少癥的實驗診斷標準。

本次研究中，6例慢性PMN減少癥患者中檢出2例存在抗PMN抗體［3-4］，雖然因病例數較少或因本實驗選用的靶抗原并未全面覆蓋AIN患者抗PMN自身抗體所有的靶抗原，因而尚不能完全反映該組患者抗PMN抗體的真實比例，但也說明在慢性PMN減少癥患者中具有較高的抗PMN抗體陽性率（若擴大檢測PMN表面抗原的指標，陽性率可能會更高）；此外，在PMN數均在參考范圍的心腦血管疾病和淋巴瘤患者中PMN表面抗原表達率下降的比例相當高，這類患者未表現出PMN數低于參考值，這可能與他們的基數較高有關，也可能其PMN表面抗原表達與特殊的遺傳背景有關。

表1 24例健康對照中性粒細胞表達CD16b和CD177的百分率

必須指出，在診斷AIN過程中需多次重復檢測粒細胞特異性抗體才能確診［5-7］。有報道SLE伴粒細胞減少的患者用流式細胞儀檢測抗體陽性率為50%～60%，而一些中性粒細胞抗體陽性者的中性粒細胞卻并不減少，因此一次粒細胞抗體陰性并不能排除AIN，需多次重復，并盡量擴大所測靶抗原的種類，而且因為一些自身免疫性疾病如SLE和Felty綜合征存在免疫復合物很容易產生假陽性，生育多胎的婦女和多次輸注血細胞的患者存在抗HLA抗體也容易產生假陽性［8］，在用抗PMN抗體診斷AIN時須綜合考慮上述因素，才能有助于臨床診斷和治療。

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Establishment of the Method Detecting Antineutrophil Antibody in Whole Blood Sample With Flow Cytometry and its Primary Clinical Application

WANG Xuan ZHU Qinghui Clinical Laboratory Department，The People's Hospital of Putuo District，Shanghai 200060，China

Objective To establish the flow cytometry（FCM）method for clinical testing neutrophil antibodies，and determine the reference ranges of CD16band CD177 antigens on neutrophil of healthy control and primarily applicate it for testing neutrophil antibodies． Methods Application of flow cytometry，forward scattering and lateral scattering parameters to distinguish the whole blood samples of lymphocytes and granulocytes，to set the granulocyte gate，respectively percentage of neutrophil surface expression of CD16b and CD177 antigen in cells with CD16b-PE and CD177-APC monoclonal antibodies to the object in the blood was selected to detect the anti CD16b or anti CD177 antibody whether or not the basis． Results The reference ranges（＞x--2s）of the expression of CD16b and CD177 on neutrophil of healthy control were defined． There were both 2 cases of patients carried with anti-CD16b and 3 cases patients carried with anti-CD177 antibodies，cardiovascular or cerebrovascular diseases and also both anti-CD16b and anti-CD177 antibodies in a patient with lymphoma，a patient with megaloblastic anemia，1 case of 6 patients with chronic neutropenia were checkouted anti-CD16b antibodies，1 case of 6 patients with chronic neutropenia was checkouted both anti-CD16b and anti-CD177 antibodies．There were no anti-CD16b or anti-CD177 antibody in 4 patients with autoimmune diseases，1 patient with thyroid hyperfunction，1 patient with anemia and 1 patient with leukemia whose PMN decreased after chemotherapy． Conclusion The flow cytometry method for detecting anti-neutrophil CD16b and CD177 antibody is simple and fast and well applicable to autoimmune neutropenia’s laboratory diagnosis and differential diagnosis．

Autoimmune neutropenia，Antineutrophil antibody，Flow cytometry

R446．3

A

1674-9316（2016）22-0151-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．22．091

普陀區人民醫院檢驗科，上海 200060 通訊作者：朱晴暉，E-mail：372895147@qq．com