血必凈對重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷的保護作用及其機制

袁偉燕，黃中偉，陳衛昌，沈雁波( 蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州5006； 南通大學附屬醫院)

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血必凈對重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷的保護作用及其機制

袁偉燕1，2，黃中偉2，陳衛昌1，沈雁波2(1 蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州215006；2 南通大學附屬醫院)

摘要：目的探討血必凈對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠肝損傷的保護作用及其對肝臟信號轉導與轉錄激活因子(p-STAT3)表達的影響。方法選擇雄性SD大鼠72只，隨機分為假手術組、模型組、血必凈組，每組24只。模型組、血必凈組采用5%?；悄懰徕c逆行胰膽管注射制備重癥SAP大鼠模型，血必凈組制模后腹腔內一次性注射血必凈4 mL/kg。假手術組打開腹腔，模擬上述操作，但不注射藥物。模型組、血必凈組于制模3、6、12 h隨機取大鼠8只，假手術組同時間各取大鼠8只，心臟穿刺取血，檢測血清ALT、AST。取血后處死，取肝組織行HE染色，觀察肝組織病理改變；免疫組化染色及Western blotting法檢測肝臟p-STAT3蛋白表達。結果模型組、血必凈組制模后各時間點血清ALT、AST水平均高于假手術組同期，且制模12 h明顯高于制模3、6 h(P均<0.05)；血必凈組制模后各時間點血清ALT、AST水平均低于模型組同期(P均<0.05)。肝組織病理觀察顯示，模型組、血必凈組肝損傷程度重于假手術組，但輕于模型組。與模型組比較，血必凈組肝臟p-STAT3蛋白表達明顯降低(P均<0.05)。結論血必凈對重癥SAP大鼠肝損傷具有一定保護作用，其機制可能與抑制p-STAT3表達有關。

關鍵詞：重癥急性胰腺炎；肝損傷；血必凈；肝臟信號轉導與轉錄激活因子；大鼠

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床常見的急危重癥，早期即可引起肺、腎、肝等多器官功能衰竭(MODS)，病死率高達40%[1]。肝臟是重癥SAP最常累及的胰外器官之一。血必凈以血府逐瘀湯為底方，主要成分為紅花、川穹、丹參、赤芍等，具有活血涼血、解毒止痛之功效?，F代藥理學研究表明，血必凈可抑制炎癥介質或細胞因子的釋放，減輕炎癥反應損傷[2，3]，對SAP本身及其累及的肝損傷可能具有保護作用，但其作用機制尚未明確。2011年11月～2015年1月，我們觀察了血必凈對重癥SAP大鼠肝損傷的保護作用，現分析結果，并探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠72只，清潔級，鼠齡8～10周，體質量250～300 g，由南通大學醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2008-0010。所有大鼠分籠喂養，自由進食和攝水，明暗周期12 h。全自動生化分析儀，德國西門子公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎機，寧波新芝科器研究所；蛋白電泳儀、圖像分析系統，美國Bio-Rad公司。血必凈注射液(規格：10 mL/支)，天津紅日藥業股份有限公司；?；悄懰徕c，美國Sigma公司；兔抗大鼠p-STAT3一抗，美國Bioworld公司；PVDF膜，美國Millipore公司；兔抗大鼠β-actin抗體、山羊抗鼠IgG二抗，美國Santa Cruz公司。

1.2動物分組及模型制備隨機將SD大鼠分為假手術組、模型組及血必凈組，每組24只。模型組、血必凈組參照Lankisch等[4]的方法，術前禁食12 h、不禁水，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，以0.1 mL/min速率向膽胰管內注入5%牛磺膽酸鈉(0.1 mL/100 g)制備重癥SAP模型。血必凈組制模后腹腔內一次性注射血必凈注射液(4 mL/kg)。假手術組打開腹腔后模擬上述操作，但不注射藥物。

1.3相關指標觀察

1.3.1肝功能指標各組分別于制模3、6、12 h隨機取8只，乙醚麻醉，心臟穿刺取血3～5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，取血清，-20 ℃冰箱凍存。應用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST。

1.3.2肝組織病理變化各組取血后處死，取新鮮肝左葉，4%甲醛溶液固定24 h，組織經脫水、透明、浸蠟，包埋制成蠟塊，4 μm厚切片，烤片后二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、HE染色。光鏡下觀察肝組織病理形態學變化。

1.3.3肝組織p-STAT3表達①免疫組化法。切片烘烤脫蠟，抗原修復，每張切片加50 μL 3% H2O2，室溫下孵育10 min，PBS沖洗；每張切片加50 μL兔抗大鼠單克隆抗體p-STAT3，4 ℃過夜，PBS沖洗；每張切片加50 μL聚合物增強劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗；每張切片加50 μL抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30 min，PBS沖洗；每張切片加50 μL新鮮配制的DAB，室溫下顯色5 min，蒸餾水沖洗。一抗的工作濃度為1∶100，以PBS作為陰性對照。p-STAT3陽性染色定位于細胞質及細胞核，呈淡黃色至棕褐色。②Western blotting法。取新鮮肝組織200 mg，RIPA裂解液裂解后冰浴下超聲勻漿，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清液，-80 ℃冰箱凍存。Bradford法蛋白定量，每孔加樣量30 μg，SDS-PAGE電泳；蛋白轉移至PVDF膜，新鮮配制的含5% BSA TBST液室溫下封閉2 h，加入兔抗大鼠p-STAT3多克隆抗體(1∶500)和兔抗大鼠β-actin抗體(1∶500)，4 ℃過夜；將膜取出，TBST液沖洗5 min×3次，加入HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗孵育2 h；ECL顯影，BandScan5.0凝膠電泳圖像分析軟件行條帶灰度掃描，以β-actin為內參對p-STAT3灰度值行半定量分析。以上實驗重復3次，取平均值。

2結果

2.1各組血清ALT、AST水平比較見表1。

表1　各組ALT、AST水平比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.05；與模型組同期比較，#P<0.05；與同組3、6 h比較，△P<0.05。

2.2各組肝組織病理變化光鏡下，假手術組各時間點肝組織結構基本正常，無壞死、出血及中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；模型組制模3 h開始可見肝竇充血，肝細胞明顯腫脹，肝索扭曲，細胞質空泡形成，肝細胞壞死，匯管區有大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，肝臟毛細血管充血、出血明顯，以制模12 h最嚴重；血必凈組各時點肝竇充血、肝細胞壞死以及匯管區中性粒細胞、淋巴細胞浸潤等均較模型組明顯減輕。

2.3各組肝組織p-STAT3表達比較免疫組化染色結果顯示，假手術組肝組織p-STAT3不表達或弱陽性表達。模型組制模3 h可見少量p-STAT3陽性細胞，主要定位于細胞質；制模6 h肝組織p-STAT3表達開始增強，著色逐漸加深；制模12 h肝組織p-STAT3表達達高峰，胞質和胞核均可見陽性表達,以胞核為主。血必凈組各時間肝組織p-STAT3表達較SAP組顯著降低，陽性細胞減少，著色減弱。各組p-STAT3蛋白表達見表2。

表2　各組肝組織p-STAT3蛋白表達比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.05；與模型組同期比較，#P<0.05；與同組3、6 h比較，△P<0.05。

3討論

SAP可產生大量炎癥介質和細胞因子，如TNF-α、IL-6等。這些炎癥介質和細胞因子可產生級聯效應，引起全身炎性反應綜合征(SIRS)或MODS。肝臟作為胰腺血液回流的第一站，又是多種細胞因子的滅活場所，因而成為SAP累及的主要胰外臟器。肝損害程度可反映SAP的嚴重程度[5]，二者呈正相關[6]。一方面嚴重的肝功能損傷可發展為肝功能衰竭，增加SAP的病死率；另一方面肝功能損傷后，肝臟的解毒作用明顯下降，致病因子容易侵入體循環，從而對全身其他器官造成損傷。酪氨酸蛋白激酶/信號轉導與轉錄激活因子(JAK/STAT)通路是多種炎癥細胞因子信號轉導的共同通路之一[7]，由一系列蛋白激酶瀑布組成。JAK2和STAT3是該家族中的重要成員，多種細胞因子包括NF-κB、TNF-α、IL-6等，可誘導JAK2活化，導致下游STAT3酪氨酸磷酸化為p-STAT3，最終引起一系列生化反應。p-STAT3表達水平能反映STAT3活化程度[8]。有研究表明，SAP肺損傷與STAT3活化密切相關[9～11]。亦有研究發現，STAT3可能在SAP早期即參與胰腺和肝組織的炎癥反應，抑制STAT3途徑可保護胰腺、肝組織損傷，其機制與調控JAK/STAT信號轉導途徑有關[12]。

血必凈以血府逐瘀湯為底方，主要成分為紅花、川穹、丹參、赤芍等，具有行氣活血、清熱涼血、解毒止痛之功效，可抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應，常用于治療膿毒血癥、SIRS及MODS等。創傷性膿毒癥發生時，細菌感染導致機體出現嚴重的SIRS，炎癥細胞因子級聯爆發，導致包括肝臟在內的各臟器繼發性損傷。早期給予血必凈可明顯減輕炎癥反應程度，增加肝臟蛋白合成能力，減少肝臟損傷[13，14]。臨床研究發現，血必凈對SAP并發的肝損傷有明顯治療作用[15，16]，但目前其作用機制尚未完全清楚。

本研究結果顯示，SAP組肝組織病理損傷明顯，各時間點血清ALT、AST水平明顯高于假手術組，制模12 h達高峰；經血必凈治療后，血清ALT、AST水平均明顯下降，肝組織病理改善明顯，提示血必凈對SAP合并的肝損傷有一定治療作用。本研究結果顯示，SAP組早期肝組織中p-STAT3表達明顯上調，隨作用時間延長，其表達逐漸升高，至12 h達高峰；血必凈組各時間點肝組織p-STAT3表達均較SAP組相應時間點明顯降低，提示p-STAT3活化可能參與了SAP肝損傷的病理過程，血必凈可能通過下調肝組織p-STAT3表達對SAP肝損傷發揮一定保護作用，但其具體機制尚需進一步研究。

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(收稿日期：2015-10-12)

中圖分類號：R657.5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)08-0030-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.011

通信作者：陳衛昌(E-mail： weichangchen@126.com)

基金項目：南通市社會發展指導性計劃(S11950)。