龍眼殼粗黃酮提取物體內外抗腫瘤研究

宋佳玉，張清偉，劉金寶，郭秋蘭（河南漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002）

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龍眼殼粗黃酮提取物體內外抗腫瘤研究

宋佳玉，張清偉，劉金寶，郭秋蘭
（河南漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002）

摘要：研究龍眼殼粗黃酮提取物體內外抗腫瘤作用。體外試驗以MTT法檢測龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109、肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用。體內試驗建立S180荷瘤小鼠模型，觀察龍眼殼粗黃酮提取物（100、200、300 mg/kg）組和龍眼殼粗黃酮提取物+CTX（20mg/kg）組的抑瘤率，計算提取物+CTX組小鼠的脾臟指數、胸腺指數、巨噬細胞吞噬指數、吞噬率，并采用ELISA法檢測提取物組小鼠血清TNF-α的水平。體外試驗顯示龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制EC109、HepG2細胞的生長，并呈現一定的濃度依賴性。體內試驗顯示龍眼殼粗黃酮提取物（低）、（中）、（高）組均可抑制S180肉瘤生長，抑瘤率分別為28.24 %、44.91 %、60.65 %；提取物（低）+CTX組、提取物（中）+CTX組、提取物（高）+CTX組抑瘤率分別為53.7 %、65.74 %、70.37 %，均高于CTX組47.69 %，且與CTX組比較，提取物+CTX組可不同程度地升高荷瘤小鼠的脾臟指數、胸腺指數、巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數；和模型組比較，提取物（低）、（中）、（高）組不增加小鼠血清TNF-α水平。龍眼殼粗黃酮提取物可抑制腫瘤細胞生長，具有抗腫瘤作用，且對CTX化療藥物具有增效減毒作用。

關鍵詞：龍眼殼粗黃酮提取物；食管癌細胞EC109；肝癌細胞HepG2；S180荷瘤小鼠；增效減毒

龍眼為無患子科龍眼屬常綠果樹，喬木。龍眼的果實俗名桂圓，又名木彈、驪珠、益智、亞荔枝、秀木團、龍目、蜜脾、比目、圓眼、川彈子、荔枝奴、燕卵、鮫淚等，為我國著名的亞熱帶水果。傳統中醫學認為，龍眼肉能安神、補氣血、益心脾，可用于治療失眠、健忘、驚悸、怔忡、虛勞羸弱[1-2]，龍眼殼無毒、味甘、性溫，其散邪祛風、聰耳明目，可治心虛頭暈，研細治湯火傷亦佳，已確定龍眼殼中含有核苷類、香豆素、多酚、萜類、糖類等[3-5]，而目前對龍眼殼中黃酮的提取研究報道較少。本研究從龍眼殼中提取了粗黃酮，并對其抗腫瘤作用進行了初步研究。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

龍眼：采自福建泉州，取其殼洗凈、烘干、粉碎；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、硝酸鋁：均為分析純；蘆丁標準品：中國藥品生物制品檢定所；環磷酰胺注射液：江蘇恒瑞醫藥有限公司。

1.2儀器

ALPHA1-2LD plus冷凍干燥儀：德國MARTIN CHRIST公司；RE-3000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器公司；AL104電子天平：上海速展機電有限公司；101C-2B電熱鼓風干燥箱：上海市實驗儀器總廠；WFJ-中草藥粉碎機：江陰市輝煌機械制造有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：陜西太康生物科技有限公司。

1.3瘤株及動物

食管癌細胞EC109、肝癌細胞HepG2、S180肉瘤瘤株：均購于河南省醫科所；昆明小鼠（雄鼠），體重（26±3）g：購于河南省醫學實驗動物中心。

1.4龍眼殼粗黃酮提取物的制備

將龍眼殼洗凈、烘干、粉碎，過60目篩，稱取約100 g，加8倍量95 %乙醇，浸泡過夜，60℃加熱回流提取，每次4 h，重復提取3次，合并3次提取液抽濾，旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥，即得龍眼殼粗黃酮提取物。1.5龍眼殼粗黃酮提取物定性鑒別

1）鹽酸-鎂粉反應：在試管中加入1 mL提取物的乙醇溶液，再加鎂粉，再加濃鹽酸2滴，進行黃酮類化合物的顯色反應；2）濃氨水反應：滴1滴提取物的乙醇溶液于濾紙上，之后將其用氨水熏30 s，在紫外燈下立即觀察；3）三氯化鋁反應：取1滴提取物的乙醇溶液，點在濾紙上，然后再滴加1滴1 %的三氯化鋁乙醇溶液，分別在可見光及紫外光下觀察顏色變化。

1.6龍眼殼提取物粗黃酮含量的測定

采用聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法，以蘆丁標準品制作標準曲線，得線性回歸方程A=1.842 9 C-0.000 4，A為510 nm處吸光度值，C為質量濃度（mg/mL），線性范圍為0～0.5 mg，相關系數R2為0.999 9。

1.7 MTT測定龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109、肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用

調整EC109、HepG2細胞濃度為2×103個/mL分別接種于96孔板中，每孔100 μL。試驗分為陰性對照組、提取物組、5-Fu組，每組設5個復孔并設空白調零孔。24 h后，陰性對照組加200 μL培養液，提取物組分別加入200 μL終濃度為0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL粗黃酮提取物，5-Fu組加200 μL終濃度為0.38 mg/mL 5-Fu，分別培養48 h后，加入MTT溶液20 μL，培養4 h后加入150 μL二甲基亞砜，用酶聯檢測儀測定各孔的光密度值（OD）。計算細胞增殖抑制率（IR）。試驗重復3次。

1.8龍眼殼粗黃酮提取物對S180肉瘤抑制作用

建立實體瘤模型，將80只昆明小鼠右腋部皮下接種濃度為1×107個/mL的S180細胞懸液，0.2 mL/只。接種后隨機分為8組，每組10只。模型組給生理鹽水；CTX組僅第1天腹腔注射CTX 20 mg/kg；提取物低、中、高劑量組分別給提取物100、200、300 mg/kg，灌胃，1 d，連續14 d；CTX+提取物低、中、高劑量組第1天腹腔注射CTX 20 mg/kg，然后分別給提取物100、200、300 mg/kg，灌胃，1 d，連續14 d。14天后將小鼠處死，稱重，計算抑瘤率。抑瘤率/%＝（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100。

1.9龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響

觀察巨噬細胞吞噬功能，按1.8方法觀察14天后，將CTX+龍眼殼粗黃酮提取物組、CTX組、模型組小鼠腹腔注射1 mL體積分數為20 %的新鮮雞紅細胞，30 min后將小鼠脫臼處死，將2 mL生理鹽水注入其腹腔，并擠壓腹部兩側，使腹腔液與生理鹽水混合均勻。將1 mL腹腔洗液滴于載玻片上，37℃孵育30 min，然后漂洗、晾干、固定、染色，再漂洗晾干。油鏡下數200個巨噬細胞，計算吞噬指數和吞噬率。吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞數/計數的巨噬細胞數（200個），吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞（200個）。稱取脾臟、胸腺重量，按照下列公式分別計算脾臟指數、胸腺指數：脾臟指數=脾臟重/體重，胸腺指數=胸腺重/體重。

1.10 ELISA法檢測荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白的表達

按1.8方法觀察14天后，眼眶采血，收集提取物組、CTX組、模型組小鼠血液0.5 mL～1.0 mL，3 000 r/min，4℃，離心10 min，然后取上清。按照小鼠TNF-αELISA試劑盒使用說明書進行操作，測定荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白含量。

1.11統計學處理

SPSS 13.0統計分析軟件分析，計量資料結果以x±s表示，行t檢驗及方差分析，P<0.05表示有統計學意義。

2　結果

2.1龍眼殼粗黃酮提取物定性檢驗結果

1）鹽酸-鎂粉反應：在泡沫處呈紫紅色；2）濃氨水反應：在紫外燈下觀察，濾紙上呈現出極明顯的灰褐色斑點；3）三氧化鋁反應：在可見光下濾紙上呈現出灰黃色斑點，在紫外光下濾紙上呈現出黃褐色熒光斑點，以上3個檢驗結果均表明提取物中含有黃酮類化合物。

2.2龍眼殼提取物中粗黃酮含量

經聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法檢測龍眼殼提取物中粗黃酮含量約為61.98 %。

2.3龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109和肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用（48 h）

龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109和肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用（48 h），結果見表1。

表1龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109和肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用（±s，n=5）Table 1 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2（x±s，n=5）

表1龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109和肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用（±s，n=5）Table 1 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2（x±s，n=5）

注：*：與陰性對照組比較，P<0.05；-：不加任何藥物。

EC109　HepG2 OD　 IR/%　 OD　 IR/%陰性對照　-　 0.30±0.023　 -　0.30　-5-Fu　 0.38　 0.16±0.009*46.67　 0.14±0.014*53.33提取物　0.10　 0.25±0.017　 16.67　 0.26±0.021　 13.33 0.30　 0.18±0.021*　38.45　 0.20±0.032*　33.33 0.60　 0.16±0.015*40.00　 0.19±0.014*36.67 0.90　 0.14±0.025*　53.33　 0.15±0.017*　50.00 1.20　 0.12±0.030*　60.00　 0.14±0.026*　53.33分組　　濃度/ （mg/mL）

由表1可見，藥物作用48 h后，龍眼殼粗黃酮提取物對食管癌細胞EC109和肝癌細胞HepG2有增殖抑制作用，且呈一定的濃度依賴性。

2.4龍眼殼粗黃酮提取物對S180肉瘤的生長抑制作用及對CTX的增效作用

眼殼粗黃酮提取物對S180肉瘤的生長抑制作用及對CTX的增效作用見表2。

表2龍眼殼粗黃酮提取物對S180肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）Table 2 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on S180 Sarcoma（±s，n=10）

表2龍眼殼粗黃酮提取物對S180肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）Table 2 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on S180 Sarcoma（±s，n=10）

注：*：與模型組比較，P<0.05；#：與CTX組比較，P<0.05；-：用生理鹽水灌胃，不用藥物。

體重/g　　瘤重/g　抑瘤率/%模型組　-　 26.11±2.79 29.05±3.34　 2.16±0.90　 -CTX組　20　 26.74±2.43 27.84±2.98　 1.13±0.73　 47.69提取物（低）　100　 26.52±1.85 29.36±2.11　 1.55±0.86*　28.24提取物（中）　200　 27.01±2.44 29.76±1.94　 1.19±0.77*　44.91提取物（高）　300　 26.21±2.78 29.97±3.01　 0.85±0.45*　60.65提取物（低）+CTX 100+20　 27.48±2.59 29.17±2.35　 1.00±0.52　 53.70提取物（中）+CTX 200+20　 27.93±2.48 28.64±3.07 0.74±0.34#65.74提取物（高）+CTX 300+20　 28.58±2.69 28.94±2.87 0.64±0.36#70.37組別　　劑量/ （mg/kg）試驗前體重/g試驗后

由表2可見，提取物低、中、高劑量組抑瘤率分別為28.24 %、44.91 %、60.65 %，可見龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制S180肉瘤生長并呈現一定量效關系；提取物（低）+CTX組、提取物（中）+CTX組、提取物（高）+ CTX組抑瘤率分別為53.7 %、65.74 %、70.37 %，高于CTX組47.69 %，可見龍眼殼粗黃酮提取物能增強CTX作用效果。

2.5龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響

龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響見表3。

由表3可見，與模型組相比，CTX組脾臟指數、胸腺指數、巨噬細胞的吞噬指數、吞噬率均降低；與CTX組相比，提取物+CTX組以上各指標均增高，且差異顯著（P<0.05）。

表3龍眼殼粗黃酮提取物對荷瘤小鼠免疫功能的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of coarse flavones extract from longan shell on the immune function of tumor bearing mice（±s，n=10）

表3龍眼殼粗黃酮提取物對荷瘤小鼠免疫功能的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of coarse flavones extract from longan shell on the immune function of tumor bearing mice（±s，n=10）

注：#：與CTX組比較，P<0.05；-：用生理鹽水灌胃，不用藥物。

組別　　量/（g/kg）胸腺指數/ 10－3脾臟指數/ 10－3吞噬百分率　　吞噬指數模型組　-　 2.04±0.32 6.56±0.87 0.31±0.08 0.54±0.12 CTX組　20　 1.65±0.18 5.17±0.74 0.15±0.06 0.18±0.07提取物（低）+CTX　 100+20　 2.48±0.65#7.68±0.89#0.29±0.07 0.65±0.17#提取物（中）+CTX　 200+20　 2.39±0.52#7.98±1.46#0.38±0.05#0.70±0.15#提取物（高）+CTX　 300+20　 2.77±0.64#8.15±1.94#0.36±0.09#0.68±0.18#

2.6龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響

龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響見表4。

表4龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of coarse flavones extract from longan shell on TNF in serum of tumor bearing mice（±s，n=10）

表4龍眼殼粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of coarse flavones extract from longan shell on TNF in serum of tumor bearing mice（±s，n=10）

注：-：用生理鹽水灌胃，不用藥物。

組別　　劑量/（g/kg）　TNF－α含量/（pg/mL）模型組　-　23.39±4.83 CTX組　20　22.87±3.22提取物（低）　100　24.34±3.98提取物（中）　200　23.67±4.45提取物（高）　300　25.11±4.89

由表4可見，提取物（低）組、提取物（中）組、提取物（高）組小鼠血清TNF-α水平和模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3　討論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，是植物在長期自然選擇過程中產生的一類次生代謝產物。它廣泛存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實等中，不僅數量種類繁多，而且結構類型復雜多樣。黃酮類化合物因其獨特的化學結構而對哺乳動物和其它類型的細胞具有許多重要的生理、生化作用，如具有抗心腦血管疾病、抗輻射、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、抗氧化、抗衰老、抑菌抗病毒、抗腫瘤、治療骨質疏松等作用[6-10]。

龍眼，俗稱桂圓，為著名的水果和重要的藥材，劉煥云[11]等采用微波輔助提取法，從龍眼殼中提取了黃酮，并證明其在體外具有一定的抗氧化作用，周瓊花[12]等從龍眼葉中提取了黃酮，并證明了其在體外也具有一定的抗氧化作用，本試驗從龍眼殼中提取了粗黃酮，并初步研究了其體內外抗腫瘤作用，體外研究結果顯示，龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制食管癌細胞EC109和肝癌細胞HepG2的生長，且呈現一定的濃度依賴性；體內試驗結果顯示龍眼殼粗黃酮提取物低、中、高劑量組可明顯抑制S180腫瘤細胞的生長，抑瘤率分別為28.24 %、44.91 %、60.65 %，提取物（低）+ CTX組、提取物（中）+CTX組、提取物（高）+CTX組抑瘤率均高于CTX組（47.69 %），其中提取物高劑量+ CTX組比CTX組的抑瘤率提高了22.68個百分點，且與CTX組比較，提取物+CTX組可不同程度地升高荷瘤小鼠的胸腺指數、脾臟指數、巨噬細胞的吞噬指數、吞噬率，可見龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制腫瘤細胞的增長，提高化療藥物CTX療效，并且能增強小鼠機體免疫力，能夠對抗化療藥物CTX所致的免疫器官萎縮，免疫力的下降等不良反應即降低CTX毒性。為了進一步的了解龍眼殼粗黃酮提取物的抗腫瘤作用機制，本試驗采用ELISA法檢測提取物組小鼠血清TNF-α的水平，試驗結果顯示模型組和提取物組TNF-α的水平差異并無統計學意義，說明龍眼殼粗黃酮提取物是通過其他機制來發揮抗腫瘤作用的，其具體抗腫瘤機制還有待于進一步深入研究。

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The Antitumor Effects of Coarse Flavones Extract from Longan Shell in Vitro and Vivo

SONG Jia-yu，ZHANG Qing-wei，LIU Jin-bao，GUO Qiu-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Abstract：To investigate the antitumor effects of coarse flavones extract from longan shell in vitro and vivo. In vitro，MTT method was used to detect the inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2. In vivo，S180-bearing mice were given coarse flavones extract from longan shell and the tumor inhibitory rates of mice were detected in coarse flavones extract（100，200，300 mg/kg）groups and coarse flavones extract combined with CTX（20 mg/kg）groups. The thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were calculated in coarse flavones extract combined with CTX proups. ELISA method was used to detect the the levels of serum TNF-α in coarse flavones extract groups. In vitro，the results showed that the coarse flavones extract of longan shell significantly inhibited the growth of EC109 andbook=41,ebook=48HepG2 cells，and showed a certain concentration dependence.In vivo，the results showed that the coarse flavones extract of longan shell（low），（middle）and（high）group could inhibit the growth of S180 sarcoma，and the inhibition rate was 28.24 %，44.91 % and 60.65 % respectively. The tumor inhibitory rates of coarse flavones extract combined with CTX were 53.7 %，65.74 %，70.37 %，which were higher than that of CTX administration alone（47.69 %）. Compared with those in CTX group，the thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly elevated in all coarse flavones extract combined with CTX groups. Compared with the model group，the extract（low），（middle）and（high）groups did not increase the level of serum TNF-αin mice. The coarse flavones extract from exocarp of longan had antitumor effect and could inhibit the growth of S180 tumor and and had synergistic attenuation effect of CTX.

Key words：coarse flavones extract from exocarp of longan；EC109；HepG2；S180-bearing mice；synergistic attenuation effect

收稿日期：2015-05-21

作者簡介：宋佳玉（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：腫瘤藥理。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.010