富硒黃豆中可溶性硒蛋白的提取工藝

李寶瑞，陳彥卓，韓杰，高俁，張安寧，鐵梅，*（.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽0036；.遼寧碧海環(huán)境保護(hù)工程監(jiān)理有限公司，遼寧沈陽008）

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富硒黃豆中可溶性硒蛋白的提取工藝

李寶瑞1，陳彥卓2，韓杰1，高俁1，張安寧1，鐵梅1，*
（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110036；2.遼寧碧海環(huán)境保護(hù)工程監(jiān)理有限公司，遼寧沈陽110081）

摘要：選擇pH=7.2的磷酸緩沖液為浸提劑從富硒黃豆中提取可溶性硒蛋白，研究了液料比、提取溫度、提取時(shí)間對黃豆蛋白提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnen的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法確定了富硒黃豆中硒蛋白提取的最佳工藝：液料比11∶1（mL/g）；提取溫度44℃；提取時(shí)間96 min；在此條件下，可溶性硒蛋白的提取率可達(dá)到76.03%。進(jìn)一步研究表明：富硒黃豆中不僅含有硒蛋白，而且還含有大量的其他有機(jī)硒化合物。

關(guān)鍵詞：富硒黃豆；硒蛋白；提取工藝

硒（Se）是人和動物的必需微量營養(yǎng)元素，具有重要的生理功能，大量資料證實(shí)或提示，硒具有廣泛的生物學(xué)作用，在預(yù)防克山病、某些癌癥和延緩衰老中發(fā)揮著重要作用[1-3]。我國2/3的地區(qū)缺硒，大量研究表明有機(jī)硒，尤其是蛋白硒毒性小、生物利用率高，因此如何獲取具有生物活性的硒蛋白，已成為人們研究的熱點(diǎn)[4-10]。我國是世界上種植黃豆的主要國家，黃豆具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，蛋白質(zhì)含量在豆類中居前列，黃豆也成為了富硒效果較好的農(nóng)產(chǎn)品[11]。

目前，國內(nèi)外分離提取黃豆蛋白仍以堿提酸沉為主，但強(qiáng)堿容易引起賴氨酸損失，產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，如賴氨酰胺丙氨酸，還可能造成蛋白質(zhì)的變性和水解，從而影響其生物活性、營養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[12-14]。因此本研究選取磷酸鹽緩沖溶液為浸提劑，探究富硒黃豆中可溶性硒蛋白提取效果的影響因素，對進(jìn)一步研究硒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性因子有著重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

富硒黃豆：種植時(shí)土壤施硒濃度分別為0、10、20、40 mg/kg；硒標(biāo)準(zhǔn)液（1 000 mg/L）：國家環(huán)保總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；硝酸、過氧化氫、硝酸鎳均為優(yōu)級純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2儀器與設(shè)備

Spectr AA 220型原子吸收光譜儀、cary50UV-Vis分光光度計(jì)：美國Varian公司；GTA110型石墨爐、MDS-2002A型壓力自控密閉微波消解系統(tǒng)：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；KJELTEC2100型半自動凱式定氮儀：瑞典富斯-特卡托公司；超純水機(jī)：美國Millipore公司；XZ-21K高速冷凍離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司、HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

黃豆樣品采收后，先用大量自來水沖洗，再以超純水洗滌3次，瀝干，裝入塑料袋中，置于-85℃冷凍冰柜冷凍24 h后，再移至真空冷凍干燥系統(tǒng)中，在真空度3.5 Pa，溫度為-55℃條件下進(jìn)行連續(xù)72 h冷凍干燥。粉碎干燥好的樣品，裝入塑料自封袋中，置干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2黃豆樣品中總硒的測定

稱取0.5 g黃豆粉末于聚四氟乙烯消化罐中，加入5 mL HNO3和1 mL H2O2，擰緊外蓋放入微波消化儀，微波消解程序?yàn)椋旱谝还げ剑? min、0.5 MPa；第二工步：2 min、1.0 MPa；第三工步：3 min、1.5 MPa；消解完成后，在可調(diào)試電熱板上加熱趕酸30 min，自然冷卻后用超純水定容至50 mL容量瓶中待測。將硒標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成硒標(biāo)準(zhǔn)工作母液（250 μg/L），利用自動進(jìn)樣器軟件稀釋系統(tǒng)將其配成50、100、150、200、250 μg/L濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。硒的吸收峰面積（A）與硒濃度（μg/L）在0～250 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為A=0.003 1C+0.014 6（r=0.994 2），檢出限為1.20 μg/L。石墨爐原子吸收光譜儀工作條件及升溫程序見表1。

表1石墨爐升溫程序Table 1 Temperature rising process of graphite furnace

1.3.3黃豆中蛋白的提取

取3 g富硒黃豆樣品，按一定的液料比加入浸提液，在一定溫度和時(shí)間下振蕩，25℃下4 000 r/min離心30 min，取上清液在冰浴下緩慢加入4倍溶液體積丙酮于-20℃冰箱放置4 h后，4℃下10 000 r/min離心20 min，棄上清液并在通風(fēng)櫥吹干丙酮，所得固體即為可溶性蛋白。

1.3.4黃豆中蛋白含量的確定

黃豆中總蛋白和可溶性蛋白的測定采用微量凱式定氮法，參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》。

富硒黃豆蛋白提取率/ %=可溶性蛋白質(zhì)含量/黃豆中總蛋白含量×100

1.3.5黃豆蛋白提取單因素試驗(yàn)

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的不同，本試驗(yàn)選擇3種中性浸提劑分別為：pH=7.2的Tris/HCl緩沖液（Tris/HCl）、pH=7.2的磷酸緩沖液（PBS）、9 %的NaCl溶液（NaCl）。以提取黃豆蛋白的液料比、時(shí)間、溫度為試驗(yàn)指標(biāo)，分別做單因素試驗(yàn)，并分析各因素對黃豆蛋白提取率的影響。

1.3.6黃豆蛋白提取的響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)的提取率作為試驗(yàn)指標(biāo)，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design），采用軟件Design Expert V8.0.6建立三因素三水平試驗(yàn)，確定黃豆蛋白的最佳提取工藝。

1.3.7黃豆中蛋白硒的測定

在最佳浸提條件下提取富硒黃豆蛋白，取20 mL浸提液于聚四氟乙烯消化罐中，加5 mL HNO3和1mL H2O2置于微波消解儀中消化。微波消解程序及蛋白硒的測定方法見1.3.2。

2　結(jié)果與分析

2.1富硒黃豆中硒含量測定結(jié)果

采用微波消解與石墨爐原子吸收光譜法對富硒黃豆中的總硒量進(jìn)行測定，對照組含硒量為58.67 μg/kg，而施硒量為10、20、40 mg/kg的黃豆中含硒量分別為177.58、322.76、629.33 μg/kg。可見隨著土壤施硒量的增加，黃豆中的總硒量呈現(xiàn)上升趨勢。

2.2富硒黃豆中總蛋白含量的測定結(jié)果

采用凱式定氮法對黃豆中蛋白進(jìn)行3次測定，4組黃豆樣品中總蛋白含量分別為37.18 %、38.80 %、39.54 %、39.02 %，說明施硒量的增加，在一定程度上會促進(jìn)了蛋白的合成。

2.3黃豆蛋白質(zhì)提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1液料比對黃豆蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取對照組黃豆粉末3 g，按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）加入浸提劑，在30℃振蕩提取30 min，考察液料比對黃豆蛋白提取的影響。結(jié)果見圖1。

如圖1所知，通過3種浸提液提取黃豆蛋白比較，磷酸鹽緩沖液的蛋白提取率較高。液料比為5∶1（mL/g）時(shí)，蛋白提取率較低，液料比達(dá)到10∶1（mL/g）時(shí)，蛋白提取率最高，隨著液料比的增加，蛋白提取率沒有明顯變化。因此選擇液料比為10∶1（mL/g）。

圖1液料比對黃豆蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of soybean protein

2.3.2浸提時(shí)間對黃豆蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取對照組黃豆粉末3 g，加入30 mL的浸提液，在30℃下分別提取30、60、90、120、150 min，考察提取時(shí)間對蛋白提取率的影響。結(jié)果見圖2。

圖2提取時(shí)間對黃豆蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of soybean protein

由圖2可知，相同條件下，3種浸提劑中，磷酸鹽緩沖液的蛋白提取率最高，其次是NaCl和Tris-HCl。當(dāng)提取液為磷酸鹽緩沖液，提取時(shí)間為90 min時(shí)，蛋白提取率最大。隨著提取時(shí)間的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。可能是隨著浸提時(shí)間的增加，蛋白的溶出逐漸達(dá)到飽和，飽和之后因?yàn)殚L時(shí)間的振蕩，蛋白質(zhì)失活，進(jìn)而使蛋白提取率降低。也有可能是由于液料比和浸提溫度的增加，溶出的蛋白經(jīng)長時(shí)間振蕩出現(xiàn)凝聚引起再沉淀，從而降低了蛋白提取率。因此提取時(shí)間選擇90 min。

2.3.3浸提溫度對黃豆蛋白提取率的影響

準(zhǔn)確稱取對照組黃豆粉末3 g，加入30 mL浸提液，分別在20、30、40、50、60℃恒溫提取30 min，考察浸提溫度對黃豆蛋白提取率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3提取溫度對黃豆蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of soybean protein

由圖3可知，磷酸鹽緩沖液的蛋白提取率要明顯高于其他2種浸提劑。隨著溫度的增高，蛋白提取率逐漸增加，但40℃時(shí)蛋白提取率開始下降，表明在上述介質(zhì)中超過40℃就會使蛋白質(zhì)逐漸變性凝固，降低蛋白溶解度。因此選擇提取溫度為40℃。

2.4黃豆蛋白提取工藝的優(yōu)化

2.4.1回歸模型的建立

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇磷酸鹽緩沖液為最適浸提劑。選取溫度、時(shí)間和液料比為考察因素，根據(jù)響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表2，響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 Factors and levels in the response surface design

表3響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of the response surface methodology for Soybean protein extraction

對表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸模擬，得到各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響回歸方程為：蛋白提取率=74.74+ 6.19A+4.92B+1.73C+1.15AB-0.23AC-0.045BC-7.64A2-3.42B2-1.38C2。通過Design-Expert軟件進(jìn)行方差分析來驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的顯著性，結(jié)果見表4。

表4模型的ANOVA分析結(jié)果Table 4 Variance analysis（ANOVA）for the fitted quadratic regression model

由表4可知，回歸方程中因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.968 9），P=0.000 2<0.01，說明次方程極顯著。失擬項(xiàng)P=0.015 6<0.05影響顯著，表明此模型可分析和預(yù)測富硒蛋白提取工藝參數(shù)。

各因素的影響程度分析，模型中的A、B、A2、B2達(dá)到極顯著水平，C、AB影響顯著，AC、BC、C2影響不顯著。由F值可知，影響蛋白質(zhì)提取率主要因素依次是A>B>C，即液料比>浸提溫度>浸提時(shí)間。

2.4.2響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出響應(yīng)曲面圖，響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對蛋白質(zhì)提取率影響的強(qiáng)弱程度，如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理?xiàng)l件的變異，而不影響到相應(yīng)值大小，相反，如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表明響應(yīng)值對于處理?xiàng)l件的改變非常敏感。各因素對黃豆蛋白提取率的影響見圖4～圖6。

比較3組圖可知：液料比對蛋白提取率的影響較大，曲線變化較陡；浸提溫度次之；浸提時(shí)間對蛋白提取率的影響最小，曲面變化比較平緩。

2.4.3最佳提取條件及驗(yàn)證

圖4液料比和提取溫度對蛋白提取率影響的響應(yīng)面Fig.4 Responsive surface of liquid/material ratio and temperature on protein extraction yield

圖5提取溫度和提取時(shí)間對蛋白提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Responsive surface of temperature and time on protein extraction yield

圖6液料比和提取時(shí)間對蛋白提取率影響的響應(yīng)面Fig.6 Responsive surface of liquid/material ratio and time on protein extraction yield

由Design Expert V8.0.6分析軟件得到的最佳浸提條件為：液料比為10.91∶1（mL/g），浸提溫度為43.96℃，浸提時(shí)間為95.77 min，理論上蛋白提取率為78.59 %。為了考慮試驗(yàn)的可行性，將最佳條件調(diào)整為液料比為11∶1（mL/g），浸提溫度為44℃，浸提時(shí)間為96 min。在此條件下，對對照組黃豆蛋白進(jìn)行浸提，通過3次平行試驗(yàn)，測得蛋白提取率為76.03 %，相對誤差為3.26 %，沒有顯著差異。

2.5富硒黃豆中蛋白硒的測定

在最優(yōu)浸提條件下分別提取4組黃豆樣品中的可溶性蛋白，對其蛋白硒的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7。

圖7黃豆中的總硒量及可溶性蛋白的含硒量Fig.7 The concentrations of total-Se and protein-Se in soybeans

由圖7可知，隨著土壤施硒量的增加，蛋白硒的含量大幅上升，對照組蛋白硒含量為15.0 μg/kg，土壤施硒40 mg/kg的黃豆中蛋白硒含量達(dá)到60.30 μg/kg。但是，隨著施硒濃度的增加，蛋白硒占總硒的比例呈下降趨勢，對照組為25.57 %，而土壤施硒40 mg/kg的黃豆蛋白硒比例僅為9.58 %，說明在富硒黃豆樣品中，非蛋白硒的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白硒。表明通過土壤施硒，能使硒在黃豆根莖組織代謝中進(jìn)一步參與多種生物合成。

3　結(jié)論

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇磷酸鹽緩沖液為浸提劑，利用Design Expert V8.0.6分析軟件進(jìn)行優(yōu)化分析得到：各因素對黃豆蛋白提取率影響大小的順序依次是液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間。提取黃豆可溶性蛋白的最佳工藝參數(shù)為液料比11∶1（mL/g），浸提溫度為44℃，浸提時(shí)間為96 min，在此條件下蛋白提取率達(dá)到76.03 %。表明響應(yīng)曲面法對于黃豆可溶性蛋白提取條件的優(yōu)化是可行的。

2）確定了蛋白最優(yōu)浸提條件后，對4組黃豆中的蛋白硒含量進(jìn)行測定，并與黃豆中的總硒量對比。結(jié)果表明，隨著土壤中施硒量的增加，不僅黃豆中總硒量在增加，而且硒還促進(jìn)了黃豆中蛋白的合成和蛋白硒的增加。

3）在富硒黃豆樣品中，除蛋白硒以外還大量存在非蛋白硒，且隨著黃豆中總硒量的增加，非蛋白硒增加的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白硒，表明富硒黃豆中不僅含有大量的蛋白硒，而且還存在著數(shù)量可觀的其他有機(jī)含硒生物大分子。至于這些非蛋白硒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步研究。

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Extraction of Soluble Selenium-containing Protein from Selenium-enriched Soybean

LI Bao-rui1，CHEN Yan-zhuo2，HAN Jie1，GAO Yu1，ZHANG An-ning1，TIE Mei1，*
（1 College of Environment，Liaoning University，Shenyang 110036，Liaoning，China；2 Liaoning Bihai Environmental Protection Engineering Supervision Company，Shenyang 110081，Liaoning，China）

Abstract：Soluble selenium-containing protein was extracted from selenium-enriched soybean by PBS（pH= 7.2）.The effects on protein extraction rate by the factors，such as liquid/ material ratio，temperature and extract time were studied. According to the single factor experiments，the optimum of extract process for seleniumenriched soybean protein was determined through Box-Benhnken central composite design and response surface methodology. The result showed that optimal condition of extraction were：liquid/material ratio 11∶1（mL/g）；extraction temperature 44℃；extraction time 96 min.Under the optimized extraction conditions，the yield of soluble selenium-containing protein was 76.03 %. Further studies showed：selenium-enriched soybean not only had selenium-containing protein，but also had other selenium-containing compounds.

Key words：selenium-enriched soybean；selenium-containing protein；extracting technology

收稿日期：2014-10-14

*通信作者

作者簡介：李寶瑞（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：土壤、農(nóng)作物、食品中微量元素的檢測方法、形態(tài)分析、遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律等。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371085）；遼寧省科技廳項(xiàng)目（2011205001）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.015