響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化紅參提取液發(fā)酵條件

李善姬，杜路平，白雪松，葛紅娟，梁承武（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

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響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化紅參提取液發(fā)酵條件

李善姬，杜路平，白雪松，葛紅娟，梁承武*
（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

摘要：研究不同發(fā)酵因素，即發(fā)酵時間、酵母接種量、發(fā)酵溫度對紅參液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken（BB）試驗(yàn)設(shè)計，對紅參液發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，發(fā)酵時間、酵母接種量、發(fā)酵溫度對紅參中人參總皂苷含量均有影響，且影響順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酵母接種量。最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間41.80h、酵母接種量0.89g/L、發(fā)酵溫度32.20℃，在此條件下人參總皂苷含量增加30.46%。

關(guān)鍵詞：紅參；人參總皂苷；響應(yīng)曲面分析；酵母

人參被人們稱為“百草之王”，是聞名遐邇的“東北三寶”之一，是馳名中外、老幼皆知的傳統(tǒng)名貴中藥材。紅參是人參最常見的炮制品，即經(jīng)過浸潤、清洗、分選、蒸制、晾曬、烘干等工序而制成[1]，一方面容易保存，另一方面還降低了有神經(jīng)毒性的田七素[2]。紅參中主要活性成分是人參皂苷，現(xiàn)已分離50多種，具有抗氧化[3]、抗抑郁的作用[4]，抗疲勞和神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[5]，抗腫瘤[6-7]作用。

最近研究表明，發(fā)酵方法可以改變?nèi)藚⒃碥盏奶擎溄Y(jié)構(gòu)，促使其向稀有皂苷轉(zhuǎn)化，從而改變紅參中人參皂苷和稀有皂苷的含量，增強(qiáng)紅參的藥理活性，促進(jìn)腸道吸收[8-10]。因此，發(fā)酵工藝是開發(fā)人參新產(chǎn)品的主要熱點(diǎn)之一。

目前國內(nèi)關(guān)于人參的研究較活躍，多集中在對不同提取方法對人參皂苷含量的影響、不同人參中皂苷含量的測定、人參皂苷中各單體皂苷的提取測定、人參皂苷的富集純化工藝，以及人參皂苷的藥理作用等方面的研究，但缺乏紅參發(fā)酵的研究，鑒于酵母菌價廉易得，同時紅參具有豐富的稀有皂苷和生物活性，因此，本試驗(yàn)擬使用安琪高活性干酵母對紅參提取液進(jìn)行發(fā)酵，以研究發(fā)酵條件對紅參皂苷含量的影響，并確定最適宜的發(fā)酵條件，以便開發(fā)多功能的發(fā)酵紅參的保健品，為紅參保健品大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)條件。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

市售的五年制人參干品；安琪高活性干酵母；正丁醇、甲醇均為分析純；人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品：中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純；去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

紅參發(fā)酵鍋（韓國）；LC-20AT高效液相：日本島津公司產(chǎn)品；CPA225D電子分析天平：德國賽多利斯公司產(chǎn)品；Symmetrix ODS-R C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱：美國Boston Analytics公司產(chǎn)品；FA1104N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS型-21-4數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；202-1A型電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TD-5A離心機(jī)；MJP-150型霉菌培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1基本流程

5年制人參干品→挑選清洗→去蘆頭→蒸、煮（紅參發(fā)酵鍋）→添加酵母→發(fā)酵→冰箱冷藏→離心→過濾→萃取→制成樣品

1.3.2人參皂苷含量的測定

將樣品按表1的梯度洗脫條件進(jìn)行洗脫，測定其中的總皂苷及單體皂苷Rg1、Re、Rb1。《中國藥典》也以人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量作為人參的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[11]。人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的量合為人參總皂苷。

表1梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取干燥好的人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品，加甲醇制成含人參皂苷Rg1 1.87 mg/mL、人參皂苷Re 2.16 mg/mL和人參皂苷Rb1 2.36 mg/mL的混合溶液，搖勻即可。

1.3.4紅參供試品溶液的制備

紅參液制備：購買市售的五年制人參干品，判斷真?zhèn)魏笕ヌJ頭并洗凈。稱取人參，放在紅參發(fā)酵鍋蒸熟24 h。然后再補(bǔ)充水煮24 h制成紅參液。

紅參供試品溶液制備：精密量取紅參液9 mL，在發(fā)酵及離心完成后，加水飽和正丁醇萃取4次，每次10 mL，收集正丁醇層，然后蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至1 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，即得紅參供試品溶液。

1.3.5單因素試驗(yàn)設(shè)計方案

在維持一個發(fā)酵條件不變的情況下，依次改變發(fā)酵時間、酵母接種量、發(fā)酵溫度，分別探究單一因素對紅參液中人參總皂苷及皂苷Rg1、Re、Rb1含量的影響。單因素實(shí)驗(yàn)，保持其它的因素不變，改變一個因素，發(fā)酵時間定為36 h，酵母接種量定為0.9 g/L，發(fā)酵溫度定為32℃。發(fā)酵時間采用24、30、36、42、48 h 5個水平；酵母接種量采用0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g/L 5個水平；發(fā)酵溫度采用28、30、32、34、36℃5個水平。

1.3.6響應(yīng)曲面的試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵時間、酵母接種量、發(fā)酵溫度這3個因素，以紅參液中總皂苷的含量為響應(yīng)值，按照Box-Behnken（BBD）試驗(yàn)設(shè)計并且進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)計為3因素3水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)。

應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件采用Box-Behnken （BBD）試驗(yàn)設(shè)計，發(fā)酵時間（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平。響應(yīng)曲面因素與水平及編碼值見表2。

表2響應(yīng)曲面因素與水平及編碼值Table 2 Factors and levels and Coded value of RSM

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1發(fā)酵時間對人參總皂苷含量的影響

發(fā)酵時間對人參總皂苷含量的影響見圖1。

圖1發(fā)酵時間對人參總皂苷含量的影響Fig.1 Fermentation time on the influence of ginseng total saponins

從圖1可以看出，人參總皂苷的含量隨著發(fā)酵時間的延長出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在42 h時人參含量達(dá)到最大。這可能是由于隨著時間的延長，使得紅參液中的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗過多而變少，酵母菌的繁殖得不到充分的營養(yǎng)及大量代謝產(chǎn)物的抑制，導(dǎo)致酵母菌總數(shù)不斷的減少，從而導(dǎo)致對人參單體皂苷之間的轉(zhuǎn)化下降。因此，選取42 h為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計。

2.1.2酵母接種量對人參總皂苷含量的影響

酵母接種量對人參總皂苷含量的影響見圖2。

圖2酵母接種量對人參總皂苷含量的影響Fig.2 Yeast inoculation quantity on the influence of ginseng total saponin content

從圖2可以看出，在0.9 g/L到1.1 g/L的過程中，人參總皂苷的含量的大致呈下降趨勢，在酵母接種量為0.9 g/L的時候達(dá)到最大值。這可能是由于隨著紅參液中營養(yǎng)成分的消耗，不可能在滿足更多的酵母菌的繁殖生長，進(jìn)而導(dǎo)致酵母菌提前進(jìn)入了衰亡期，使得轉(zhuǎn)化人參皂苷開始下降。因此，本試驗(yàn)選取酵母接種量0.9 g/L為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計。

2.1.3發(fā)酵溫度對人參總皂苷含量的影響

發(fā)酵溫度對人參總皂苷含量的影響見圖3。

圖3發(fā)酵溫度對人參總皂苷含量的影響Fig.3 Fermentation temperature on the influence of ginseng total saponin content

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵溫度由28℃增加到36℃過程中，人參總皂苷的含量呈現(xiàn)出先增加后下降的整體變化趨勢，在32℃時達(dá)到最大值。發(fā)酵溫度會影響到酵母菌的生長發(fā)育以及人參中各單體皂苷的相互轉(zhuǎn)化，從而造成了發(fā)酵液中的總皂苷含量的差異變化。因此，選取32℃為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計。

2.2 Box-Behnken（BBD）試驗(yàn)結(jié)果及發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面方案及分析結(jié)果

響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken（BBD）分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The Box - Behnken（BBD）analysis and test results

2.2.2響應(yīng)曲面回歸方程及方差分析及模型可信度分析

應(yīng)用Design Expert8.0.5對表3的結(jié)果進(jìn)行分析，得出人參總皂苷含量R1與因素變量A，B，C的回歸方程：R1 =-312.167 98 +2.063 92×A +67.900 12×B + 15.475 32×C－0.611 17×A×B + 1.255 77×10-4×A× C + 0.686 94×B×C－0.018 695×A2－36.395 38×B2－0.250 30×C2

或者編碼的響應(yīng)曲面二次回歸方程模型為：

R1=10.44－0.098×A－0.13×B+0.25×C－0.37×A×B+ 0.015×A×C+0.14×B×C－0.67×A2－0.36×B2－1.00×C2

式中：R1為人參總皂苷含量；A為發(fā)酵時間；B為酵母接種量；C為發(fā)酵溫度。

表4響應(yīng)曲面方差分析表Table 4 Response surface analysis of variance

續(xù)表4響應(yīng)曲面方差分析表Continue table 4 Response surface analysis of variance

由表4方差分析結(jié)果可知，該模型很顯著（P＜0.0001），意味著只有小于0.01%的機(jī)會，模型的F值可能會出現(xiàn)大的抗噪能力；失擬項P＞0.05，不顯著，表明該回歸方程擬合性好，可用來預(yù)測實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果。

方程中一次項B，C，AB，二次項A2，B2，C2顯著。表明各實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系。各因素對紅參液中人參總皂苷含量影響大小關(guān)系順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酵母接種量，且3種因素對紅參液中皂苷含量都有影響。

表5模型可信度分析Table 5 Analysis of model reliability

由模型可信度分析表5可知，該方程擬合度R2= 0.986 6，說明該模型能解釋98.66 %的變化，表明方程擬合良好；C.V（人參總皂苷R1的變異系數(shù)）表示試驗(yàn)的精確度，C.V值越小，表明試驗(yàn)的可靠性越高；預(yù)測擬合度值0.8904與校正擬合度值0.969 3相近；信噪比（一般信噪比值大于或等于4即可取），試驗(yàn)信噪比為20.504，表明該模型可以用于指導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計。綜上所述，該模型設(shè)計合理，可以用來對發(fā)酵條件對紅參皂苷含量的影響進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.3試驗(yàn)因素交互作用分析

2.3.1發(fā)酵時間與酵母接種量

二者交互作用的影響見下圖4（a）和（b）。

由圖4（a）可知，保持酵母接種量不變，在較小的的發(fā)酵時間水平，隨著發(fā)酵時間的延長，人參總皂苷濃度快速增加，而隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步延長，人參總皂苷濃度趨于平緩，達(dá)到峰值后略有下降。保持發(fā)酵時間不變，隨著酵母接種量的增加，人參總皂苷濃度逐漸增至最大值，而后略有下降。所以推出，酵母接種量和發(fā)酵時間均對人參總皂苷含量有一定影響，且酵母接種量和發(fā)酵時間的交互作用對人參總皂苷含量也有影響。

圖4發(fā)酵時間和酵母接種量交互影響的響應(yīng)面曲線（a）與等高線（b）Fig.4 Response surface plot（a）and contour plot（b）of the effect of fermentation time and yeast inoculation quantity

2.3.2發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度

二者交互作用的影響見下圖5（a）和（b）。

圖5發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度交互影響的響應(yīng)面曲線（a）與等高線（b）Fig.5 Response surface plot（a）and contour plot（b）of the effect of fermentation time and Fermentation temperature

由圖5（a）可知，保持發(fā)酵時間不變，在較低的發(fā)酵溫度水平，隨著發(fā)酵溫度的上升，人參總皂苷濃度快速增加，而隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步上升，人參總皂苷濃度增加趨于平緩，當(dāng)達(dá)到峰值后，有下降。保持發(fā)酵溫度不變，隨著發(fā)酵時間的延長，人參總皂苷濃度逐漸增至最大值，當(dāng)達(dá)到峰值后，略有下降。所以推出，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間均對人參總皂苷含量有一定影響，且發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用對人參總皂苷含量也有影響。2.3.3酵母接種量與發(fā)酵溫度

二者交互作用影響見下圖6（a）和（b）。

圖6酵母接種量和發(fā)酵溫度交互影響的響應(yīng)面曲線（a）與等高線（b）Fig.6 Response surface plot（a）and contour plot（b）of the effect of yeast inoculation quantity and Fermentation temperature

由圖6（a）可知，保持酵母接種量不變，在較低的發(fā)酵溫度水平，隨著發(fā)酵溫度的上升，人參總皂苷濃度快速增加，而隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步上升，人參總皂苷濃度增加趨于平緩，當(dāng)達(dá)到峰值后，開始下降。保持發(fā)酵溫度不變，隨著酵母接種量的增加，人參總皂苷濃度逐漸增至最大值，而后，略有下降。所以推出，酵母接種量和發(fā)酵時間均對人參總皂苷含量有一定影響，且酵母接種量和發(fā)酵時間的交互作用對人參皂苷含量也有影響。

通過上述分析可知，發(fā)酵時間、酵母接種量、發(fā)酵溫度對紅參液中人參總皂苷含量均有影響，且發(fā)酵溫度對人參總皂苷濃度的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，其次為發(fā)酵時間，影響相對較低的是酵母接種量，表現(xiàn)為曲面相對平滑。影響大小順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酵母接種量。

2.4響應(yīng)曲面優(yōu)化發(fā)酵條件

發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化值見表6。

表6響應(yīng)面優(yōu)化值Table 6 Response surface optimization value

由表6可知響應(yīng)曲面優(yōu)化最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間41.80 h，酵母接種量為0.89 g/L，發(fā)酵溫度32.23℃，人參總皂苷濃度為10.464 5 mg/100 mL。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，聯(lián)系實(shí)際操作的便利情況，對各因素適當(dāng)調(diào)整。在調(diào)整后的試驗(yàn)因素下進(jìn)行3次試驗(yàn)。將上述最佳工藝條件修正為：發(fā)酵時間為42 h、酵母接種量0.89 g/L、發(fā)酵溫度32℃。結(jié)果見表7。

表7驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Test results

由表7可知，試驗(yàn)結(jié)果有較好的重復(fù)性，3次試驗(yàn)的人參總皂苷濃度的平均值為10.492 3 mg/100 mL，實(shí)際測定值為（10.492 3±0.086 34）mg/100 mL，與理論預(yù)測值10.464 5相近（相對誤差為0.27 %）。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，回歸模型可以比較好的擬合紅參液的實(shí)際發(fā)酵過

程，具有較好的參考價值。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化紅參液發(fā)酵條件。結(jié)果表明，酵母發(fā)酵后的紅參液中的人參總皂苷含量較發(fā)酵前的含量增加。發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、酵母接種量對紅參液中人參皂苷含量均有影響，且它們的影響不是簡單地線性關(guān)系，3個因素影響主次關(guān)系為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞酵母接種量。利用Design-Expert8.0.6軟件對Box-Behnken（BBD）試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明,紅參液發(fā)酵的最佳條件是：發(fā)酵時間為42 h、酵母接種量0.89 g/L、發(fā)酵溫度32℃，實(shí)際測定值（10.492 3± 0.086 3）mg/100 mL，與理論預(yù)測值10.464 5 mg/100 mL相近，相對誤差為0.27 %，說明真實(shí)值和預(yù)測值擬合效果較好。試驗(yàn)驗(yàn)證表明，回歸模型可以較好地用來指導(dǎo)和預(yù)測紅參液的發(fā)酵。

參考文獻(xiàn)：

[1]李卓艷,李德坤,周大錚,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選紅參加工工藝[J].中成藥,2011, 33(6):1005-1007

[2]李向高,鄭毅男,張連學(xué),等.田七素在加工紅參中的變化及其轉(zhuǎn)化機(jī)理[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,27(4):405-407

[3]黃海英.人參皂苷Rg1藥理作用研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志, 2012,28(7):608-609

[4]黃世敬.人參抗抑郁研究進(jìn)展[J].時針國醫(yī)國藥,2014,25(1):175-177

[5]丁艷芬,李江霞,楊崇仁.人參皂苷Rh1的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥,2013,15(4):282-284

[6] Jian Jie, Hu Zhi-Fang, Huang Yuan. Effect of ginsenoside Rg3 on Pim -3 and Bad proteins in human pancreatic Cancer cell line PANC-1[J].Chin J Cancer,2009,28(5):461

[7]郭志廷,褚秀玲,付本懂,等.人參皂苷-Rh2抗腫瘤機(jī)理的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(9):742-745

[8]陳林軍,王瑩,蔡東聯(lián),等.人參皂苷Rg1與1,6二磷酸果糖配伍抗疲勞作用的研究[J].氨基酸和生物資源,2010,32(4):58-62

[9]趙方允,陳自宏,虞泓,等.微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3): 216-219

[10] PARK CS,YOO MH, NOH KH, et al. Biotransformation of ginsenosides by hydrolyzing the sugar moieties of ginsenosides using microbial glycosidases[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(1): 9-19

[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005: 7-8

Optimization of Fermentation Conditions on the Red Ginseng Saponin Content by the Response Surface Methodology

LI Shan-ji，DU Lu-ping，BAI Xue-song，GE Hong-juan，LIANG Cheng-wu*
（Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：To explore the effects of different fermentation conditions，namely，the fermentation time，yeast inoculation quantity，fermentation temperature，on the total content of saponin Rg1，Re，Rb1 on red ginseng. And based on the single factor experiment and using the response surface analysis of Box-Behnken（BB）experimental design to optimize the fermentation conditions. The results showed that The fermentation temperature，fermentation time，yeast inoculation quantity has an effect on the total saponin content of red ginseng and the order of effect as follows：fermentation temperature> fermentation time> yeast inoculation quantity. The optimum process was as follow：fermentation time was 41.80 h，yeast inoculation quantity was 0.89 g/L，fermentation temperature was 32.20℃，Under the optimal process conditions，the total saponin contents was increased 30.46 %.

Key words：red ginseng；total saponin；response surface analysis；yeast

收稿日期：2015-09-02

*通信作者：梁承武（1968—），教授，博士。

作者簡介：李善姬（1969—），女（朝鮮），副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)。

基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究（吉教科合字2015 第400）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.031