HPLC同時測定豆制品中3種堿性橙染料

金鑰，崔進，梅連瑞，李經緯，閆師杰，劉祥，*（1.天津農學院水產學院，天津300384；.國家加工食品質量監督檢驗中心，天津300308；3.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384；4.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津300384）

?

HPLC同時測定豆制品中3種堿性橙染料

金鑰1，2，崔進2，梅連瑞2，李經緯2，閆師杰3，4，*，劉祥2，*
（1.天津農學院水產學院，天津300384；2.國家加工食品質量監督檢驗中心，天津300308；3.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384；4.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津300384）

摘要：建立腐竹等固體豆制品中堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22染料含量的高效液相色譜檢測方法。樣品經無水乙醇提取，超聲波輔助萃取，離心合并上清液，經旋轉蒸發儀濃縮至近干，定容液溶解殘渣，離心吸取上清液，過0.45 μm膜經高效液相色譜分離、檢測。所用色譜柱為C(18)，檢測波長堿性橙2為449 nm，堿性橙21、堿性橙22為485 nm；流動相為甲醇-乙酸銨水溶液。本方法檢測限為0.02 mg/kg；定量限為0.08 mg/kg。腐竹樣品加標回收率試驗所得回收率為83.1 %～116.7%，相對標準偏差（RSD）為1.02%～9.65%（n=6），3種染料在0.1μg/mL～20μg/mL濃度范圍內均呈良好的線性關系，線性回歸系數（r）均大于0.9999。

關鍵詞：高效液相色譜法；豆制品；堿性橙2；堿性橙21；堿性橙22

堿性橙是一種偶氮類堿性工業染料，主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色，對人有致癌、致畸變等影響。根據《中華人民共和國食品安全國家標準食品添加劑使用標準》及《中華人民共和國食品安全法》的相關規定，為禁止用作食品添加劑的化學制品，而由于堿性橙染料比其它水溶性染料如檸檬黃、日落黃等更易于在鮮海魚和豆制品上染色且不易褪色，因此一些不法商販為了增加食品的色澤光亮，以次充好，在鮮海魚、豆制品、腐竹等食品中使用堿性橙染色[1]，極大危害了消費者的身心健康。為保護消費者的健康，通過對此類食品進行定性和定量檢測，有效地保障了食品的市場安全。

堿性橙染料的種類主要有堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22 3種[2]。目前較多使用高效液相色譜法進行分析檢測，但前處理相對繁瑣，耗時較長且浪費溶劑[3-4]。本研究建立了通過無水乙醇提取，超聲波輔助萃取的前處理方法，冷凍離心去除脂類，省去了液液萃取去除脂類的步驟，利用HPLC同時檢測堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22的含量，取得了滿意的效果。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters H-Class高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器：Waters公司；ML204/02天平：Mettler-Toledo公司；FB15060超聲波清洗器、ST 16R低溫高速離心機：美國Thermo Fisher公司；RV 10旋轉蒸發儀、A11分析研磨機、VORTEX圓周混合器：德國IKA公司。

超純水：Milli-Q Integral 10，法國Merck Millpore公司；甲醇：色譜純，美國Honeywell公司；堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22：均為國家標準物質，德國Dr.公司。1.2標準物質配制

儲備液的配制：分別準確移取100 mg（精確至0.1 mg）堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混勻，4℃條件下避光保存；中間液的配制：分別準確移取1 mL堿性橙染料標準儲備液于10 mL容量瓶中，用定容液至刻度，混勻；工作液的配制：準確移取適量中間液于10 mL容量瓶中，分別配制為濃度0.1、0.5、1、2、20μg/mL，用定容液至刻度，混勻備用。用流動相作為定容液進行定容。

1.3樣品處理方法

稱取5 g（精確到0.01 g）粉碎好的干腐竹[5]樣品于50 mL塑料離心管內，加入2 g無水硫酸鈉[6]，10 mL無水乙醇超聲提取20 min，9 000 r/min，離心5 min，上層清夜置于另一離心管中，重復提取2次，合并提取液；再5 000 r/min，離心10 min；轉移上清液于圓底燒瓶中，在30℃，60 r/min減壓的條件下旋轉蒸發至近干；加入5 mL定容液，用超聲清洗儀溶解殘渣[7]，轉移至離心管，9000r/min，離心5min，吸取上清液，經0.45μm濾膜過濾，供高效液相色譜儀上機分析檢測。

1.4色譜分析條件

色譜柱：4.6 mm×150 mm，C18反相柱（5 μm）；檢測波長：堿性橙2為449 nm；堿性橙21、堿性橙22為485 nm；流動相：甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）為62∶ 38（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10.0 μL。

2　結果與討論

2.1樣品前處理條件的優化

分別考慮了無水乙醇、甲醇、乙腈對陽性樣品的萃取試驗，結果3種有機試劑的提取效率差別不大，而考慮乙腈、甲醇毒性均比無水乙醇大，價格也相對比無水乙醇高，選擇無水乙醇作為提取劑；提取劑的用量比較了5、10、20 mL，結果為5 mL提取不充分，而20 mL浪費提取劑且旋轉蒸發慢，10 mL時提取充分且旋蒸快；對超聲萃取時間和提取次數綜合考慮，時間考慮了15、20、30 min，提取次數考慮了1、2、3次。結果顯示，無水乙醇超聲萃取20 min，提取2次，提取不但完全而且節約時間；而根據腐竹樣品中含有脂類，以往文獻均采用液液萃取的方法去除脂類，本文中定容液溶解殘渣后，不經液液萃取，而是殘渣轉移至離心管中，用冷凍離心機進行離心，去除樣品中脂類等雜質，上清液過膜上機檢測。

2.2色譜分離條件的優化

分別考慮了Waters symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Waters symmetry Shied RPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱，結果為Waters symmetry C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）的分離效果好，各標準物質的保留時間短、峰型好；檢測器方面對檢測波長進行了篩選，結果顯示堿性橙2的檢測波長為449 nm；堿性橙21、堿性橙22的檢測波長為485 nm；同時也比較了乙腈：水（含0.02 mol/L乙酸銨）、乙腈：水（含0.1 %甲酸）、甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）、甲醇：水（含0.1 %甲酸）不同流動相體系[8]，綜合各種不同的流動相和流動相配比，發現甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）為62∶38（體積比）時，體系能夠更有效地分離，色譜峰形更優，靈敏度更高，因此選用甲醇：水（含0.02 mol/L乙酸銨）為62∶38（體積比）作為流動相。圖1、圖2為3種堿性橙染料的標準圖譜。

圖1堿性橙21、堿性橙22在485 nm下標準物質色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of basic orange 21 and basic orange 22 standards determined by UV detector at 485 nm

圖2堿性橙2在449 nm下標準物質色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of basic orange 2 standard determined by UV detector at 449 nm

2.3線性情況、定量限、檢出限、回收率及相對標準偏差

用已經配制好的標準工作液，各濃度分別進樣10.0 μL，測定結果經線性回歸，線性良好，結果如圖3、圖4、圖5。

圖3堿性橙2在線性范圍0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲線Fig.3 Calibration curve of basic orange 2 in 0.1 μg/mL-20 μg/mL

圖4堿性橙21在線性范圍0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲線Fig.4 Calibrationcurveofbasicorange21in0.1 μg/mL-20 μg/mL

圖5堿性橙22在線性范圍0.1 μg/mL～20 μg/mL的校正曲線Fig.5 Calibrationcurveofbasicorange22in0.1 μg/mL-20 μg/mL

用腐竹空白樣品作為基質，添加不同量的堿性橙染料標準品后按“1. 2”處理后測定，確定各堿性橙染料的線性范圍、定量限（LOQ，S /N>10）、檢出限（LOD，S/N >3），見表1；不同添加量下的回收率和相對標準偏差，見表2；同時測定陰性樣品，得到空白樣品色譜圖，如圖6；添加水平1 mg/kg的樣品色譜圖，如圖7、8。

表1堿性橙染料的線性情況以及定量限、檢出限Table 1 Linear regression，correlation coefficient and the limit of detection and quantitation

表2堿性橙染料回收率試驗結果Table 2 Results of test for recovery

圖6空白樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank sample

圖7堿性橙21、22添加1 mg/kg樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of basic orange 21 and 22 add 1 mg/kg

圖8堿性橙2添加1 mg/kg樣品色譜圖Fig.8 Chromatogram of basic orange 2 add 1 mg/kg

3　結論

建立了腐竹中禁用堿性橙染料的高效液相色譜檢測方法。用乙醇多次超聲萃取，用冷凍離心機去除脂類等雜質，采用超聲法和冷凍離心機進行的樣品前處理成本低、速度快；用甲醇-乙酸銨水溶液作流動相。方法具有靈敏度高、重現性好、回收率較高的特點，各項指標滿足分析的要求，適合腐竹等固體豆制品中堿性橙染料的檢測。

參考文獻：

[1]林欽,鄭小嚴,何樹坤,等.高效色譜法同時檢測食品中的堿性橙、堿性嫩黃O和堿性桃紅T染料含量[J].食品科學, 2009, 30(14): 194-196

[2]楊琳,陳青俊,丁獻榮,等.高效液相色譜法測定食品中3種堿性橙含量[J].理化檢驗(化學分冊),2011(7):768-770

[3]高潔,尹峰,何國亮,等.高效液相色譜法測定豆制品中的堿性嫩黃O[J].分析試驗室,2008,27(Z1):230-232

[4]羅美中,李碧芳,何小青.高效液相色譜-二極管陣列法測定豆制品中堿性嫩黃O的含量[J].食品工業科技,2005,26(8):166-167

[5]林燦城,游卓銘.腐竹中堿性嫩黃O和堿性橙Ⅱ測定方法探討[J].廣東衛生防疫,2013(5):82-83

[6]林欽.高效液相色譜法同時測定豆制品中的堿性橙和堿性嫩黃O染料[J].色譜,2007,25(5):776-777

[7]江迎鴻,陳亞波,邱舜鈿,等.超聲提取-高效液相色譜法測定食品中堿性橙Ⅱ染料[J].食品研究與開發,2009,30(7):153-155

[8]鐵曉威,黃百芬,任一平,等.RP-HPLC法測定染色黃魚中的堿性橙含量[J].中國衛生檢驗雜志, 2004, 14(1):59-60

HPLC Determination of 3 Basic Orange Dyes in Bean Products

JIN Yue1，2，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，LI Jing-wei2，YAN Shi-jie3，4，*，LIU Xiang2，*
（1. College of Aquaculture，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2. National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Tianjin 300308，China；3. College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；4. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

Abstract：A method for the simultaneous determination of basic orange 2，basic orange 21 and basic orange 22 contents in bean products was developed by high performance liquid chromatography（HPLC）. The sample was extracted by ethanol and sonicator，then centrifuged by centrifuge，the extracts were combined in vacuum to dryness，the residue was dissolved in a given solution，drew supernatants were after centrifuged，separated and detected by HPLC after 0.45 μm membrane. The column was C(18)，the detection wavelength basic orange 2 is 449 nm，basic orange 21，basic orange 22 are 485 nm；mobile phase was methanol-aqueous ammonium acetate. The linear ranges of this method for determining the three pigments were 0.1 μg/mL-20 μg/mL and the correlation coefficients（r）all were higher than 0.999 9. The recoveries at three levels respectively ranged from 83.1 % to 116.7 %，and the RSDs were 1.02 %-9.65 %（n= 6）. The limits of detection were about 0.02 mg/kg，the limit of quantitation were about 0.08 mg/kg.

Key words：high performance liquid chromatography；bean products；basic orange 2；basic orange 21；basic orange 22

收稿日期：2015-04-17

*通信作者：閆師杰（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事食品質量與安全方面的研究與教學；劉祥（1976—），男（漢），正高級工程師，博士，主要從事食品安全檢測與分析。

作者簡介：金鑰（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，主要從事動物性食品安全與營養方面的研究。

基金項目：國家重大科學儀器設備開發專項（2013YQ510391）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.036