一種簡(jiǎn)單有效檢測(cè)牛乳中抗生素殘留的方法

王濤，李宏梁，*，張莉，舒靜（.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安700；.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安70048）

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一種簡(jiǎn)單有效檢測(cè)牛乳中抗生素殘留的方法

王濤1，李宏梁1，*，張莉2，舒靜2
（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安710048）

摘要：根據(jù)當(dāng)牛乳不含抗生素或抗生素濃度很低時(shí)，乳酸菌能發(fā)酵牛乳生成酸奶的原理，建立了乳酸菌抑制法來(lái)檢測(cè)牛乳中抗生素殘留。具體步驟為：稱取約100 g純牛乳/復(fù)原乳，90℃、10 min殺菌，冷卻至（43±1）℃，接檢測(cè)菌種3 %～4 %，并加入1mL溴甲酚紫指示劑，攪拌均勻，（43±1）℃下發(fā)酵。若發(fā)酵2.5 h發(fā)酵液仍為紫色，可初步判定為有抗奶；若發(fā)酵4h仍未凝乳，則確定為有抗奶，反之，則為無(wú)抗奶。該方法操作簡(jiǎn)單、乳酸菌劑購(gòu)買方便且易保存，適于在企業(yè)推廣。

關(guān)鍵詞：牛乳；乳酸菌抑制法；抗生素殘留

乳房炎是奶牛患病率最高的一種微生物感染性疾病，同時(shí)也是奶牛的第一殺手，因?yàn)楦腥緡?yán)重的乳房炎很難治愈，奶牛就會(huì)當(dāng)做肉牛被屠宰[1-2]。因此，小劑量的抗生素添加到飼料中預(yù)防乳房炎[3]，大劑量抗生素廣泛用于治療乳房炎[4]，人為將抗生素添加到鮮乳中防止腐敗變質(zhì)，這是牛乳中抗生素殘留的主要原因[5-6]。牛乳中抗生素殘留不僅嚴(yán)重影響發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)加工（如酸奶、奶酪），造成經(jīng)濟(jì)損失[7-8]，而且長(zhǎng)期飲用含抗生素的乳品后，抗生素在人體內(nèi)不斷積累，對(duì)健康有巨大危害[9]，可能導(dǎo)致人體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生一定的耐藥性等[6，10-11]，更加嚴(yán)重的是對(duì)男性生殖功能存在潛在危害[12]，又如氯霉素，會(huì)導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥[13]。實(shí)踐表明，凡是能發(fā)酵酸乳的乳源都是來(lái)自于未患乳房炎等疾病、未注射消炎針和疫苗的健康奶牛，反之，乳酸菌不能在有抗乳中發(fā)酵酸乳。因此，從理論上講，采用乳酸菌抑制法能夠有效鑒別鮮乳中是否含有抗生素[5]。直投式乳酸菌凍干發(fā)酵劑商品化程度高，來(lái)源廣泛、價(jià)格不高，且保存方便。因此，本文就乳酸菌抑制法檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留進(jìn)行研究，并利用該方法對(duì)市售純牛乳和乳粉進(jìn)行檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

無(wú)抗純牛乳：陜西銀橋生物科技有限公司；乳酸菌YO-MIXTM207 LYO：丹尼斯克（中國(guó)）有限公司；溴甲酚紫[變色范圍：6.8（紫色）～5.2（黃色）]、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；青霉素：哈藥集團(tuán)有限公司獸藥廠，規(guī)格：2.4 g（400萬(wàn)單位）。

1.1.2儀器

HH-2型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SPX-150B（F）生化培養(yǎng)箱：上海瑞豐儀器儀表有限公司；SG2酸度計(jì)（pH計(jì)）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，B203LEDR生物顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；MLS-3780不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2方法

1.2.1乳酸菌抑制法的建立

1.2.1.1檢測(cè)菌種的制備

稱取約150 g～200 g無(wú)抗脫脂牛乳于250 mL燒杯中，90℃、10 min殺菌后，將燒杯放入涼水中迅速冷卻至50℃左右，自然冷卻至（43±1）℃，撒入極少量乳酸菌干粉菌劑（能看見菌粉即可），無(wú)需攪拌，用無(wú)菌紙和棉線包扎封口，立即在（43±1）℃恒溫箱中靜置發(fā)酵6 h～7 h，肉眼可見凝固后取出，2℃～5℃冰箱保存?zhèn)溆肹14]。每7 d重新制備1次。測(cè)定檢測(cè)菌種活菌數(shù)方法參考GB 4789.35-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]。

1.2.1.2乳酸菌抑制法最佳發(fā)酵條件的確定

稱取約100 g無(wú)抗脫脂牛乳于250 mL燒杯中，90℃、10 min殺菌后，將燒杯放入涼水中迅速冷卻至50℃左右，分別以接種量1 %、2 %、3 %、4 %、5 %；發(fā)酵溫度37、40、43、46、49℃；發(fā)酵時(shí)間2.5、3、3.5、4、4.5 h為單因素，測(cè)定pH、酸度、觀察凝乳情況、冷藏后酸乳質(zhì)地及乳清析出量，從而確定最佳接種量、最佳發(fā)酵溫度及最佳發(fā)酵時(shí)間。酸度測(cè)定方法參考GB 5413.34-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測(cè)定》[16]。

1.2.1.3指示劑的選擇

準(zhǔn)確稱取0.01 g青霉素，用無(wú)菌磷酸緩沖溶液（2.83 g磷酸二氫鈉、1.36 g磷酸二氫鉀、1 000 mL蒸餾水）稀釋10 000倍配置成1 mg/kg儲(chǔ)備液。用無(wú)抗脫脂乳稀釋10倍配置成100 μg/kg的青霉素有抗奶樣品，稀釋100倍配置成10 μg/kg的青霉素有抗奶樣品。以100 g無(wú)抗純牛乳、10 μg/kg的青霉素有抗奶樣品及100 μg/kg的青霉素有抗奶樣品為原料，在乳酸菌抑制法最佳發(fā)酵條件和操作步驟下發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間1.5、2、2.5、3、3.5、4 h發(fā)酵液的pH，并觀察凝乳情況。

1.2.2乳酸菌抑制法與GB法對(duì)市售純牛乳和乳粉進(jìn)行檢測(cè)

對(duì)市售純牛乳和乳粉進(jìn)行采樣，乳粉按質(zhì)量比1∶10用蒸餾水復(fù)溶。用乳酸菌抑制法和GB/T 4789.27-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)》對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)[17]，驗(yàn)證乳酸菌抑制法的可行性和準(zhǔn)確性。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)菌種的制備

檢測(cè)菌種鏡檢圖如圖1所示，檢測(cè)菌種活菌數(shù)測(cè)定圖如圖2所示。

圖1檢測(cè)菌種鏡檢圖Fig.1 Microscopy of detection strain

圖2檢測(cè)菌種活菌數(shù)測(cè)定圖Fig.2 Living bacteria of detection strain

通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)酵6 h～7 h、冷藏16 h后的檢測(cè)菌種菌體生長(zhǎng)形態(tài)，嗜熱鏈球菌菌體呈圓形或者卵圓形，成對(duì)、短鏈排列；保加利亞乳桿菌菌體呈長(zhǎng)桿狀，單個(gè)或者成對(duì)、短鏈排列。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌均處于生長(zhǎng)旺盛期，而且無(wú)雜菌污染，測(cè)定檢測(cè)菌種的活菌數(shù)為6.7×108cfu/g，綜上所述，制備的菌種適合做檢測(cè)菌種。

2.2乳酸菌抑制法最佳發(fā)酵條件的確定

單因素試驗(yàn)表明，接種量過(guò)小，凝乳質(zhì)地軟，接種量過(guò)大，凝乳質(zhì)地硬，酸味大，接種量為3 %～4 %時(shí)，凝乳質(zhì)地較好，乳清析出較少。發(fā)酵溫度較低（如37℃）或較高（如49℃）時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)繁殖受到抑制，產(chǎn)酸速度及產(chǎn)酸量降低，凝乳時(shí)間>8 h；當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃或46℃時(shí)，產(chǎn)酸速度較快、凝乳質(zhì)地較好，部分乳清析出；當(dāng)發(fā)酵溫度為43℃時(shí)，產(chǎn)酸速度快，凝乳質(zhì)地好，無(wú)乳清析出，且口感好。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間不足（＜3 h）時(shí)，酸奶酸度不夠，凝乳質(zhì)地軟、黏稠，無(wú)法形成凝乳；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（>4.5 h）時(shí)，凝乳質(zhì)地硬，酸味大；只有發(fā)酵時(shí)間合適（3.5 h～4.5 h）時(shí)，凝乳質(zhì)地好，且無(wú)乳清析出。綜上所述，乳酸菌抑制法發(fā)酵酸奶最佳接種量為3 %～4 %，最佳發(fā)酵溫度為（43±1）℃，最佳發(fā)酵時(shí)間為3.5 h～4.5 h。

2.3指示劑的選擇

抗生素對(duì)牛乳發(fā)酵過(guò)程中pH的影響如圖3所示，抗生素對(duì)牛乳發(fā)酵過(guò)程中ΔpH的影響如圖4所示。

圖3抗生素對(duì)牛乳發(fā)酵過(guò)程中pH的影響Fig.3 Effect of antibiotic on pH of milk in fermentation process

圖4抗生素對(duì)牛乳發(fā)酵過(guò)程中ΔpH的影響Fig.4 Effect of antibiotic on Δ pH of milk in fermentation process

由圖3、圖4可知，在發(fā)酵時(shí)間為2.5 h時(shí)，10 μg/kg的青霉素有抗奶的ΔpH（ΔpH＝pH有抗奶-pH無(wú)抗奶）最大，100 μg/kg的青霉素有抗奶在2 h～4 h范圍內(nèi)的ΔpH均大于0.8，可以看出，不管是高濃度有抗奶，還是低濃度有抗奶，發(fā)酵2.5 h的ΔpH均大于0.4，也就是說(shuō)發(fā)酵2.5 h的pH能夠很好反映有抗奶和無(wú)抗奶的差異，且無(wú)抗奶發(fā)酵2.5 h，pH下降到5.2以下，而有抗奶發(fā)酵2.5 h的pH在5.2以上，這一差異可以用溴甲酚紫指示劑直觀反映。

綜上所述，乳酸菌抑制法最佳發(fā)酵條件及操作步驟為：稱取約100 g純牛乳/復(fù)原乳待檢樣品于250 mL燒杯中，90℃、10 min殺菌后，將燒杯放入涼水中迅速冷卻至50℃左右，自然冷卻至（43±1）℃，接檢測(cè)菌種3 %～4 %，并加入1mL溴甲酚紫指示劑，攪拌均勻，（43±1）℃恒溫箱中靜置發(fā)酵。判定方法為：若發(fā)酵2.5 h顏色仍為紫色，初步判定該純牛乳/復(fù)原乳為有抗奶，若發(fā)酵4 h仍未凝乳或者凝乳不正常，則可確定該牛乳/復(fù)原乳為有抗乳；若發(fā)酵2.5 h顏色變?yōu)辄S色，發(fā)酵4 h后凝乳均勻，無(wú)氣泡，無(wú)分層，無(wú)乳清析出，色澤均勻，制作的酸奶口感柔和細(xì)膩，爽口潤(rùn)滑，酸度適中，乳香濃郁，則證明該牛乳/復(fù)原乳待檢樣品為無(wú)抗乳。

2.4乳酸菌抑制法與GB法對(duì)純市售純牛乳和乳粉的檢測(cè)結(jié)果

乳酸菌抑制法與GB法對(duì)市售純牛乳和乳粉的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1乳酸菌抑制法與GB法對(duì)市售純牛乳和乳粉的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of commercial pure milk and milk powder by lactic acid bacteria inhibition and GB method

表1是乳酸菌抑制法與GB/T 4789.27-2008對(duì)市售純牛乳和乳粉的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，乳酸菌抑制法在2.5 h檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品中，純牛乳有83.3 %的樣品用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)的結(jié)果也是陽(yáng)性，乳粉有76.4 %的樣品用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)的結(jié)果也是陽(yáng)性。乳酸菌抑制法在4 h未凝乳檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。假設(shè)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，那么雖然乳酸菌抑制法在發(fā)酵2.5 h以指示劑是否變色為判定法則的檢測(cè)限低于發(fā)酵4 h以是否凝乳為判定法則的檢測(cè)限，但以發(fā)酵2.5 h為判定法則的正確率為76.4 %～83.3 %，而以發(fā)酵4 h是否凝乳為判定法則的正確率為100 %。所以，發(fā)酵2.5 h根據(jù)顯色反應(yīng)可以作為初步判定方法，發(fā)酵4 h根據(jù)是否凝乳可以確定樣品是否為無(wú)抗奶。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)建立了乳酸菌抑制法來(lái)檢測(cè)牛乳中抗生素的殘留。具體步驟為：稱取約100 g純牛乳待檢樣品于250 mL燒杯中，90℃、10 min殺菌后，將燒杯放入涼水中迅速冷卻至50℃左右，自然冷卻至（43±1）℃，接檢測(cè)菌種3 %～4 %，并加入1mL溴甲酚紫指示劑，攪拌均勻，（43±1）℃恒溫箱中靜置發(fā)酵。判定方法為：若發(fā)酵2.5 h顏色仍為紫色，初步判定該純牛乳/復(fù)原乳為有抗奶，若發(fā)酵4 h仍未凝乳或者凝乳不正常，則可確定該純牛乳/復(fù)原乳為有抗乳；若發(fā)酵2.5 h顏色變?yōu)辄S色，發(fā)酵4 h后發(fā)生凝乳，則證明該純牛乳/復(fù)原乳為無(wú)抗乳。

乳酸菌抑制法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、菌種來(lái)源廣泛且易于保存，能夠一次性處理大批樣品，是現(xiàn)有鑒別無(wú)抗奶和測(cè)定牛乳中獸藥殘留方法的有效補(bǔ)充，對(duì)提高乳制品質(zhì)量、降低檢測(cè)成本、完善乳品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、促進(jìn)我國(guó)乳品行業(yè)健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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[17]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 4789.27-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008

A Simple and Effective Method for the Detection of Antibiotics Residues in Milk

WANG Tao1，LI Hong-liang1，*，ZHANG Li2，SHU Jing2
（1. School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi′an 710021，Shaanxi，China；2. Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an 710048，Shaanxi，China）

Abstract：Lactic acid bacteria ferment milk makes yogurt when there is no，or very low amount of antibiotic in milk. The method of testing antibiotic in milk by lactic acid bacteria inhibition was established. Detail steps were：100 g milk or reconstituted was sterilized at 90℃，10 min，cooled to（43±1）℃，inoculated 3 %～4 %，and 1mL Chlorophenol Red solution added as an indicator，stirred well and incubated at（43±1）℃. If the color of fermentation broth was still purple after 2.5 h，we can preliminary judge the milk may contain antibotics；If it was did not curd after 4 h，we can confirm the milk contains antibotics，otherwise，it is no-antibotics milk. The operation of the method is simple，and lactic acid bacteria is easily available and preserved. Thus，the method is suitable for promotion in industry.

Key words：milk；lactic acid bacteria inhibition method；antibiotic residues

收稿日期：2015-11-27

*通信作者

作者簡(jiǎn)介：王濤（1990—），男（漢），在讀研究生，研究方向：乳制品安全檢測(cè)。

基金項(xiàng)目：陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研項(xiàng)目（2015K123）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.038