不同形態中國對蝦貯藏過程中產生生物胺變化的分析

胡禮淵，孫高英，廖和菁（廣西東興出入境檢驗檢疫局，廣西東興538100）

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不同形態中國對蝦貯藏過程中產生生物胺變化的分析

胡禮淵，孫高英，廖和菁
（廣西東興出入境檢驗檢疫局，廣西東興538100）

摘要：為提高進出口對蝦風險監控水平，利用反相高效液相色譜法測定不同形態中國對蝦貯藏過程中產生生物胺的變化，結合感官檢驗、pH和菌落總數檢測結果，分析對蝦腐敗進程及其原因。結果表明，在0℃和4℃下貯藏，腐胺和尸胺變化最顯著，貯藏第10天質量分數分別為（206.48±14.19）mg/kg，（162.45±18.13）mg/kg和（397.48±14.19）mg/kg，（201.95±15.84）mg/kg；25℃下貯藏產生的主要生物胺是酪胺，貯藏10天質量分數達（675.66±20.25）mg/kg，其次是腐胺和尸胺。確定不同形態的對蝦在0、4、25℃下貯藏，整蝦的可接受期為5、4、1 d，蝦仁可接受期為7、5、1 d，細菌是造成蝦體內生物胺累積的主要原因。

關鍵詞：中國對蝦；生物胺；腐敗；細菌；貯藏

生物胺是具有生物活性的一類低分子量有機含氮化合物，廣泛存在于各類食品，尤其是高蛋白食品中。生物胺在機體內的主要形成途徑是游離態氨基酸的脫羧反應，也有部分生物胺是醛和酮氨化或轉氨作用而形成的，按其組成成分可分為單胺（組胺、酪胺、苯乙胺、章魚胺）、二胺（腐胺、尸胺）和多胺（精胺、亞精胺）[1]。對人體健康危害最大的組胺和酪胺；腐胺和尸胺通過競爭機體中的解毒酶，從而增加組胺和酪胺的毒性，并且能夠與亞硝基鹽反應生成亞硝基吡咯烷、亞硝基哌啶等致癌物質；精胺和亞精胺能促進DNA、RNA和蛋白質的合成，加速機體生長發育，是細胞增殖的重要物質；章魚胺是一種重要的神經介質，有調節代謝和能量平衡的功效；苯乙胺有神經調節物質、神經遞質與示蹤胺的作用[2]。生物胺是生物體內的正常生理組分，具有非常重要的生理功能，是合成荷爾蒙、核酸、蛋白質的前體，但當人體攝入過量的生物胺時，會引起頭痛、惡心、心悸、血壓變化呼吸紊亂等過敏反應，嚴重的還會危及生命[3]。在貯藏過程中，細菌產生的消化酶以及對蝦自身的自溶酶把蛋白質分解成氨基酸，經攜帶脫羧酶的微生物脫羧而形成生物胺，其產生的前體條件是：1）機體中含有游離的氨基酸；2）滿足脫羧反應的條件；3）適宜微生物生長的環境。有研究發現，假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacteria）、發光桿菌屬（Photobacterium）、弧菌屬（Vibrio）是對蝦腸道中發現最多的生物胺產生菌[4-8]。

中國對蝦是我國養殖產量最高的三大名蝦之一，具有個體大、肉質緊實，顏色鮮美等特點，并含有多種維生素及人體必須的微量元素，是高蛋白營養水產品。近年來，僅靠國內養殖的產量已跟不上消費需求，從東南亞國家進口的中國對蝦數量有逐年增長的趨勢，研究不同形態中國對蝦貯藏過程中產生生物胺的變化，可以為水產品風險監控檢測，運輸貯藏保鮮技術等提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

實驗用中國對蝦依據SC/T 3016-2004《水產品抽樣方法》[9]抽檢于同一報檢批越南進口冰鮮對蝦，符合GB 18406.4-2001《農產品安全質量無公害水產品安全要求》[10]的鮮度和感官要求，抽樣量為1000g，規格為30尾/ 1000g，裝入聚乙烯抽樣袋，上覆碎冰，封口運至實驗室，2h內制樣。取15尾對蝦去頭、去殼、去消化腺和鰓絲，僅留可食部分肌肉，制成蝦仁，與另外15尾整蝦各平均分為3組，分別置于0、4℃冰箱和25℃恒溫箱中貯藏。

1.1.2試劑

苯乙胺（Phe）、組胺（His）、腐胺（Put）、酪胺（Tyr）（純度皆為98%），尸胺（Cad）、亞精胺（Spe）（純度為99%），章魚胺（Oct）（純度95 %），丹磺酰氯（純度98 %）：均購自美國Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇均為色譜純：德國CNW公司；其他試劑（皆為分析純）：廣東西隴化工有限公司；試驗用水為超純水：美國Millipore公司。

1.1.3儀器和設備

AgiLent 1200高效液相色譜儀（四元梯度泵）配紫外檢測器，3-30K臺式高速冷凍離心機：美國Sigma公司；SJ-Ⅱ均質器：上海昆蟲科技開發公司；pHS-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；CHP9270恒溫箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；CPA224S十萬分之一電子天平。

1.1.4色譜條件

色譜柱：AgiLent SB C18反相色譜柱，250 mm× 4.6 mm；柱溫：35℃；流動相：A：0.01 mol/L乙酸銨，B：水+乙腈（10+90）含0.01 mol/L乙酸銨；流速1 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2方法

1.2.1感官評價

以氣味、色澤、肌肉彈性為感官評價指標，將對蝦的質量分為3個等級：1.可接受級（無異味、色澤光鮮、肌肉緊實），2.初期腐敗級（有輕微腐敗氣味、色澤微紅、肉質半透明），3.腐敗級（異味明顯、色澤暗淡、肉質軟化），對整蝦和蝦仁進行評價。

1.2.2 pH測定

取可食部分肌肉，用剪刀剪碎，混勻。稱取5.0 g放入離心管中，平行稱3份，加入45 mL超純水，攪拌均勻，放置30 min進行浸出，并不斷振搖，然后過濾，濾液用酸度計測定，直接讀出pH。

1.2.3菌落總數測定

參照GB/T 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[11]操作。

1.2.4生物胺測定

稱取2.00g樣品，置于50mL離心管中，加入10mL 0.4mol/L高氯酸溶液，均質1min，4000r/min離心5min，上清液移入25mL容量瓶中，沉淀物用10 mL 0.4 moL/L高氯酸溶液重復提取1次，合并上清液，用0.4moL/L高氯酸定容至刻度。取1.0 mL提取液加入5 mL容量瓶中，依次加入0.1 mL 2 moL/L氫氧化鈉溶液、0.3 mL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL 10 mg/mL丹酰氯溶液，蓋塞，于40℃避光反應45 min，然后加入0.1 mL 25 %～28 %氫氧化銨，靜置30 min，用乙腈定容到刻度，取1 mL過0.45 μm濾膜后進樣，紫外檢測器檢測，外標法定量。

1.2.5統計分析

使用SPSS V16.0軟件，對不同貯藏條件下，中國對蝦的pH、菌落總數、生物胺含量進行統計分析比較，EXCEL2007繪圖。

2　結果與分析

2.1品質指標的變化

中國對蝦在不同貯藏條件下感官等級和pH的變化見表2。

表2不同貯藏條件下中國對蝦感官等級、pH的變化Table 2 Changes in pH and sensory rating of Chinese shrimp during different storage condition

由表2可知，在10 d的貯藏時間里，對蝦品質逐漸下降，至第8天，所有試驗組都出現不同程度的腐敗，不適宜食用，說明貯藏溫度越高，腐敗速度越快。0、4、25℃貯藏條件下，中國對蝦感官可接受時間分別為6 d～8 d、4 d～6 d、0.5 d～1 d。蝦仁和整蝦相比較，相同溫度下，蝦仁感官可接受期比整蝦滯后1 d～2 d，貯藏溫度越低差異越顯著。在整個貯藏過程中pH從接近中性的（7.06±0.02）升至腐敗后的大于8，總體趨勢是上升的。0、4、25℃貯藏條件下，溫度越高，pH升高速率越大，相互間差異顯著（P<0.05），整蝦pH升速大于蝦仁pH的升速。值得注意的是，感官等級出現變化時，pH上升的速率最大，當對蝦品質達到腐敗級后，pH上升緩慢，說明而蝦體中的蛋白質、氨基酸及其他含氮物質被分解為吲哚、氨、三甲胺等呈堿性的產物不斷增加，pH持續上升，隨著機體中分解出的小分子化合物增多，能被微生物利用的小分子化合物越多，細菌增殖的速度就越快，對蝦品質下降明顯。

2.2菌落總數的變化

不同形態的中國對蝦儲藏于0、4、25℃時活菌數的變化見圖1和圖2。

圖1中國對蝦（整蝦）儲藏于0、4、25℃時活菌數的變化Fig.1 Chinese shrimp（whole shrimp）stored at 0，4，25℃，changes in the number of viable cells

圖2中國對蝦（蝦仁）貯藏于0、4、25℃時活菌數的變化Fig.2 Chinese shrimp（Peeled prawns）stored at 0，4，25℃，changes in the number of viable cells

有研究表明，對蝦細菌總數（個/g）≤105為一級鮮度；≤5×105為二級鮮度；細菌總數達到106～107時，對蝦已嚴重腐敗，不能食用[12]。由圖1圖2中得知，對蝦初始細菌總數的對數值為4.12，在整個貯藏期內呈上升趨勢。0℃下整蝦冰藏5 d，細菌總數達過了6 lg（cfu/g），已不能食用，而經過處理的蝦仁冰藏5 d僅為5.09 lg （cfu/g），至第7天為6.76 lg（cfu/g）；4℃下整蝦冷藏4 d細菌總數就達到6.95 l g（cfu/g），蝦仁冷藏4 d僅為5.78 lg（cfu/g），至第5天達到6.62 lg（cfu/g）；25℃下恒溫貯藏僅1 d后細菌總數就超過106個/g這個腐敗限值，說明25℃時中低溫菌繁殖和新陳代謝加速，酶的活性增強，導致蝦體內酶促和生化等一系列反應的速度加快，整蝦和蝦仁兩者差異不顯著（P>0.05）。結果表明，冰藏比冷藏對細菌生長的抑制效果更顯著（P＜0.05），在0、4、25℃下貯藏，整蝦可接受期為5、4、1 d，蝦仁可接受期為7、5、1 d，與感官等級、pH變化趨勢基本一致。

細菌是造成水產品腐敗最主要的因素，蝦體中細菌數量：腸道>胃>肝胰腺>鰓>甲殼>肌肉。王祥紅等在野生中國對蝦腸道中分離出47株菌8個屬，其中優勢菌屬為弧菌屬、發光桿菌屬，次優勢菌屬為假單胞菌屬[13]，Dempsey等對蝦類的腸道菌群進行了研究，分離并鑒定了腸道菌群的好氧菌，發現弧菌屬、產堿菌屬、氣單胞菌屬、發光桿菌屬和假單胞菌屬占優勢[14]。在對蝦生長不同時期，腸道菌群的數量和組成主要受內因（腸的結構和發育階段）和外因（攝食對象，水體環境，溫度等）的影響[15]。腸炎弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌等易引起感染型食物中毒的致病菌在10℃以下不能正常發育，但有少數好氣和厭氣低溫細菌即使在0℃也能旺盛的生長[16]。當對蝦死亡后，細菌從甲殼和消化道侵入肌肉，也可以從鰓絲經血液系統侵入到肌肉內，鮮蝦去頭、殼、消化道后低溫貯藏能降低肌肉被致病菌污染的風險，因此，低溫貯藏能有效抑制細菌的增殖，延長對蝦的可接受期。

2.3生物胺含量變化

在0、4、25℃下貯藏0、2、4、6、8、10 d，測定中國對蝦體內生物胺變化的情況，結果見表3。

表3不同貯藏條件下中國對蝦產生生物胺的變化Table 3 Changes in biogenic amines rating of Chinese shrimp during different storage condition

表3可見，生物胺總量隨著貯藏時間的延長而增加。在0、4℃下貯藏，腐胺和尸胺是變化最顯著的生物胺，貯藏初始僅檢出有少量亞精胺，至貯藏終期酪胺和亞精胺變化呈輕微波動的規律，0℃下貯藏，腐胺和尸胺的質量分數第10天達到（206.48±14.19）mg/kg和（162.45±18.13）mg/kg；4℃下貯藏，腐胺和尸胺的質量分數第10天達到（397.48±14.19）mg/kg和（201.95± 15.84）mg/kg，在對蝦感官等級變化時，腐胺和尸胺的質量分數上升明顯，0℃和4℃兩種貯藏溫度相比，中國對蝦生物胺變化差異顯著（P＜0.05）。蝦仁在經過去殼、頭、消化腺后，單位含菌量上要低于整蝦，這在一定程度上會影響到低溫貯藏時腐胺和尸胺的質量分數，實驗數據與預期結果相符。25℃下貯藏，酪胺是主要生物胺，其質量分數在第2天急速升高到（343.31± 13.24）mg/kg，貯藏終期高達（675.66±20.25）mg/kg，遠超靜脈注射小鼠LD50229 mg/kg限值，足以危及人體生命安全，FDA認為，酪胺的安全閾值建議參考上限為100 mg/kg～800 mg/kg[17]，而腐胺和尸胺的質量分數至第10天僅為（191.82±10.64）mg/kg和（49.44±4.02）mg/kg。針對高溫貯藏會改變細菌優勢菌種的種類，進而影響主要生物胺產生的現象，Guizani[18]分析了生物胺產生菌的性質，認為這些菌一般為嗜溫菌，所以20℃更加容易產生生物胺，相關研究有待進一步深入。在0、4、25℃下貯藏，組胺、章魚胺和苯乙胺始終沒有檢出。

亞精胺由精氨酸脫羧產生，是生物體內的必需物質，貯藏初期呈上升趨勢，到第4天最高，然后持續下降。有學者認為在腐胺的產生過程中，精氨酸很有可能被利用作為腐胺的前體物質，從而競爭性抑制精氨酸的產生[19]。甲殼類的肌肉中幾乎沒有肌肽和游離組氨酸，因而不太可能會產生組胺，但是其肌肉中含有大量的磷酸精氨酸，精氨酸與鳥氨酸之間可以相互轉化，因此能產生大量的腐胺。Rezaei等研究表明，當假單胞菌為主要腐敗菌時其主要的生物胺為尸胺和腐胺[20]。Huss發現假單胞菌需氧、嗜冷生長，能分泌嗜鐵素等物質抑制其他競爭細菌的生長，同時分泌高活性蛋白酶和脫羧酶，因此被認為有氧冷藏特定腐敗菌[21]。實驗結果顯示，相同溫度下貯藏不同形態的蝦仁和整蝦，兩者間差異顯著（P＜0.05），蝦仁能有效降低活菌數，進而抑制生物胺產生，對對蝦貯藏的防腐保鮮有積極意義。

3　結論

中國對蝦的感官等級、pH、菌落總數和生物胺總量的變化規律具有一致性，可作為鮮度評價的參考指標。不同形態的對蝦在0、4、25℃下貯藏，整蝦的可接受期為5、4、1 d，蝦仁可接受期為7、5、1 d。中國對蝦低溫貯藏產生的主要生物胺是腐胺和尸胺，常溫貯藏產生大量酪胺，細菌是造成蝦體內生物胺累積的主要原因。

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Produce Different Forms of Chinese Shrimp during Storage Analysis of Changes in Biogenic Amines

HU Li-yuan，SUN Gao-ying，LIAO He-jing
（Dongxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

Abstract：In order to improve the level of imports and exports of shrimp risk monitoring，measuring different forms of Chinese shrimp produced changes in biogenic amines during storage，combined with sensory testing using reverse-phase high performance liquid chromatography，pH and the total number of colonies of the test results，the analysis process and the reasons for corruption shrimp . The results show that at 0℃and 4℃storage，putrescine and cadaverine was most remarkable，storage first 10 days quality scores were（206.48± 14.19）mg/kg，（162.45±18.13）mg/kg and（397.48±14.19）mg/kg，（201.95±15.84）mg/kg；mainly biogenic amines produced under 25℃storage is tyramine，storage 10 days the mass fraction of（675.66±20.25）mg/kg，followed by putrescine and cadaverine. Determine the different forms of shrimp at 0，4，25℃storage，whole shrimp acceptable period of 5，4，1 d，shrimp acceptable period of 7，5，1 d，bacteria are the main cause of shrimp in vivo accumulation of biogenic amines .

Key words：Chinese shrimp；biogenic amines；corruption；bacteria；storage

收稿日期：2014-10-09

作者簡介：胡禮淵（1979—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：水產品檢測。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.043