芝麻香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物群落結構特征的磷脂脂肪酸（PLFA）分析

曹　宇，翟　磊，信春暉，許　玲，姚　粟，程　池(.中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京0007；.山東扳倒井股份有限公司，山東淄博56300)

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芝麻香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物群落結構特征的磷脂脂肪酸（PLFA）分析

曹宇1，翟磊1，信春暉2，許玲2，姚粟1，程池1
(1.中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京100027；2.山東扳倒井股份有限公司，山東淄博256300)

摘要：高溫大曲是芝麻香型白酒釀造特有的糖化發酵劑，為白酒釀造提供豐富的微生物種類、各種生物酶類以及多種香味前驅物質，在傳統白酒釀造過程中發揮重要的作用。本研究采用磷脂脂肪酸分析方法(phospholipid fatty acid，PLFA)對芝麻香型白酒高溫大曲生產過程中微生物生物量和群落結構的動態變化進行了研究。結果表明，真菌在整個制曲過程中占主導地位,細菌的含量和種類在第1次和第2次翻曲的過程中出現規律性變化，推測這兩次翻曲在制曲過程中起著關鍵作用。

關鍵詞：芝麻香型白酒；高溫大曲；磷脂脂肪酸（PLFA）；微生物群落

芝麻香型白酒是我國傳統白酒的創新香型，也是魯酒的代表香型，以其濃、醬、清相結合的工藝特點和獨特的優雅芝麻香味，符合白酒淡雅、爽凈的消費趨勢[1-2]。芝麻香型白酒的工藝特點包括高溫制曲、高氮配料、高溫堆積、高溫發酵、多微共酵、分層蒸餾、長期貯存和科學勾兌。大曲是我國固態白酒釀造特有的糖化發酵劑，含有大量微生物和酶類，在傳統白酒釀造過程中發揮重要的作用，故釀酒離不開曲，曲的品質決定酒質。高溫大曲是以小麥等為主要原料，經多種微生物混合自然固態發酵而成，發酵最高溫度可達到65℃。高溫大曲為白酒釀造提供豐富的微生物種類、各種生物酶類以及多種香味前驅物質，在傳統白酒釀造過程中發揮重要的作用[3-5]。高溫大曲中的微生物種類和數量直接決定著芝麻香型白酒的產量和質量。因此，研究高溫大曲中微生物數量、群落結構及在發酵過程中微生物群落的變化情況等，對芝麻香型白酒的釀造機理和呈香機理都有重要作用，并對芝麻香型白酒釀造工藝的優化具有重要意義[6-7]。

近年來對高溫大曲微生物群落多樣性研究的報道較多，主要集中在采用可培養方法和非培養方法研究其微生物群落多樣性。張明春等[8]采用傳統分離培養和理化指標分析方法，對白云邊高溫大曲和中溫大曲進行了比較研究，研究發現耐高溫的芽孢桿菌含量和種類較多；施安輝等[1]采用傳統分離培養方法對徐坊芝麻香型白酒大曲的微生物分布進行了分析，鑒定的微生物菌種包括細菌、酵母、霉菌和放線菌；Zheng等[9]采用傳統的分析方法對我國8種不同香型白酒的高溫、中溫和低溫大曲微生物多樣性進行分析，認為大曲中的微生物具有多樣性和功能性，是白酒釀造過程中的重要菌劑；葛媛媛等[10]利用高溫篩選和傳統培養方法，借助于核糖體DNA擴增片段限制性內切酶(ARDRA)分型、分子鑒定以及系統發育分析技術，研究了芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱細菌群落結構，篩選獲得的85株嗜熱細菌分別屬于Thermoactinomyces sp.，Bacillus sp.，Schlegelella sp.以及Streptomyces sp.，4個菌屬，其中第1優勢菌為Thermoactinomyces vulgaris，豐度為69. 41 %；姚粟等[11]利用克隆文庫的方法研究了芝麻香型白酒高溫大曲的細菌群落多樣性，發現Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Lactobacillus和Weissella。

磷脂脂肪酸（PLFA）是存在于活細胞中的重要膜成分，是表征樣品中活體生物量和生物群落多樣性的重要標記。不同種屬之間微生物差異明顯,且對于環境因素較為敏感,通過監測特征磷脂脂肪酸組成和數量的變化，揭示微生態環境中微生物群落結構組成及變化規律，目前廣泛的應用于微生物生態學的研究中[12-18]。本研究通過磷脂脂肪酸方法分析芝麻香型白酒高溫大曲生產過程中微生物生物量和群落結構的動態變化，以期對芝麻香型白酒的釀造提供理論指導。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1樣品采集

2014年8月到2014年10月共采集11批制備不同階段的山東扳倒井股份有限公司高溫大曲樣品，表1列出了高溫大曲樣品的基本特征。每批次采樣都取曲房四邊部分及中間部分的5個曲塊進行粉碎混合，混合后的樣品作為一個樣品，密封，冷藏備用。

表1　高溫大曲樣品特征

1.1.2主要儀器及試劑

氣相色譜(Agilent GC 6850 Series)，Agilent；冷凍真空離心濃縮儀，Labconco；硅膠萃取小柱(SampliQ Silica)，Agilent。

定量標準品：1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，Avanti公司。除正己烷為色譜純外，其他有機試劑均為分析純。

1.2PLFA測定方法

1.2.1PLFA的提取

稱取1 g大曲樣品于離心管中，加入5 mL 50 mM磷酸緩沖液（pH7.4）、6 mL氯仿和12 mL甲醇，并加入5 μL 2.5 mM 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine作為內標，振蕩2 h，室溫下3500 r/min離心10 min。取上清液于分液漏斗，將沉淀加入5 mL磷酸緩沖液，6 mL三氯甲烷，12 mL甲醇，振蕩30 min，室溫下3500 r/min離心10 min，將上清液與之前的上清液合并，加入分液漏斗后，加入12 mL氯仿，12 mL磷酸緩沖液，振蕩2 min，過夜靜置分層，取下層溶液于玻璃試管中，真空離心濃縮儀中旋干，加入5份200 μL氯仿溶解總脂肪酸后轉移到硅膠萃取小柱中，分別加入5 mL氯仿、5 mL丙酮（2次）和少量甲醇清洗小柱后，加入5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管中，旋干即得到磷脂脂肪酸。

1.2.2PLFA甲基化

磷脂脂肪酸溶于1 mL甲苯與甲醇的混合液（v/v，1∶1），加入1 mL 0.2 M氫氧化鉀，搖勻，37℃水浴15 min，加入0.3 mL 1 M醋酸溶液，再加入2 mL正己烷，2 mL超純水萃取得到上層清液于玻璃試管中，再用2 mL正己烷重復萃取1次，取上清液合并到剛才試管中，旋干得到甲基化的磷脂脂肪酸，于4℃下保存待測。

1.2.3PLFA的氣相色譜分析

磷脂脂肪酸樣品用1 mL的正己烷溶解，進行氣相色譜分析。氣相色譜儀配備分流/不分流進樣口，氫火焰離子化檢測器(FID)及Agilent氣相色譜化學工作站。色譜柱為Ultra-2柱，長25 min，內徑0.2 mm，液膜厚度0.33 μm；爐溫為二階程序升溫：起始溫度170℃，5℃/min升至260℃，隨后40℃/min升至310℃，維持1.5 min；進樣口溫度250℃，載氣為氫氣，流速0.5 mL/min，分流進樣模式，分流比100∶1，進樣2 μL；檢測器溫度300℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，補充氣(氮氣)流速30 mL/min。

1.3數據處理

磷脂脂肪酸（PLFA）的鑒定和分析采用美國MIDI公司(MIDI, Newark, Delaware, USA)開發的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的Sherlock MIS 4.5系統(Sherlock Microbial Identification System)。

2　結果與分析

2.1高溫大曲發酵過程中PLFA變化

圖1　高溫大曲制作過程中樣品PLFAs總量變化圖

通過檢測高溫大曲制備過程中不同階段曲樣PLFA含量（圖1），發現高溫大曲樣品的PLFA含量在0.35～3.23 mol/g，其中第20天和第25天曲樣PLFA含量達到最大值，為3.2 mol/g，而此時恰好是第2次翻曲和第3次翻曲，第23天曲樣PLFA含量最低為0.3 mol/g，位于2次翻曲之間，可見翻曲對曲樣PLFA含量的影響很大。

磷脂脂肪酸分析主要檢測碳鏈長度C9～C24的PLFA，我們將這些PLFA分為直鏈脂肪酸（Straight）、支鏈飽和脂肪酸（Branched）、單不飽和脂肪酸（PUFA）、多不飽和脂肪酸（MUFA）、環化脂肪酸（Cyclo）、羥基脂肪酸(Hydroxy)、10-甲基脂肪酸(10-methyl)以及二甲縮醛化脂肪酸(DMA)多種類型。測定結果表明，在高溫大曲制作過程中脂肪酸18∶2 w6,9c，支鏈飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸的含量占主導地位（70 %～90 %），并且表現出一定的規律性。脂肪酸18∶2 w6,9c和直鏈脂肪酸都呈現先減少后增加的趨勢，而支鏈飽和脂肪酸呈先增加后減少的趨勢，其中制曲的第9天（第1次翻曲）和第20天（第2次翻曲）是變化的轉折點，也是高溫大曲制備過程中的潛在關鍵點。

圖2　高溫大曲制作過程中樣品PLFAs組成變化圖

2.2高溫大曲發酵過程中微生物群落結構特征的變化情況

微生物群落結構，即微生物不同類群的相對豐度，可通過各微生物類群的脂肪酸相對含量表征[19-20]，多不飽和脂肪酸可以作為真核微生物的標志，而18∶2 w6,9和18:1ω9作為真菌的標志，單不飽和脂肪酸則可以表征好氧革蘭氏陰性菌，支鏈脂肪酸用于表征革蘭氏陽性菌，10-甲基脂肪酸表征放線菌，二甲縮醛化脂肪酸表征厭氧細菌。

表2　用于生物分類的PLFAs標記

高溫大曲制作過程中生物多樣性分析結果表明，真菌在整個過程中占主導地位（14.19 %～67.03 %），其含量呈現波浪形變化，先降低后升高，最低點出現在第9天和第20天曲樣，革蘭氏陽性菌（10.37 %～34.34 %），革蘭氏陰性菌（7.87 %～35.9 %）以及真核生物（3.27 %～18.82 %）的含量也呈現波浪形變化，先升高后降低，最高點出現在第9天和第20天的曲樣。此外，整個制曲過程中厭氧菌、放線菌以及絲狀真菌的含量都很低，這可能與這些菌無法在高溫下生長有關。生物多樣性組成分析發現，第1次翻曲和第2次翻曲對生物尤其是微生物群落結果有很大的影響，推測是高溫大曲制備過程中的潛在關鍵點。

圖3　高溫大曲制作過程中樣品生物組成變化圖

對大曲的PLFA分析結果進行聚類分析，結果發現不同發酵時期的大曲可分為4類（見圖4）。圖4表明，發酵9 d、20 d的大曲聚為一組，發酵12 d大曲單獨聚為一組，0 d、2 d、5 d、15 d、23 d、25 d、45 d的大曲聚為一組，而發酵36 d的大曲單獨聚為一組。PLFA分析結果的系統發育分析與聚類分析結果一致（見圖5）。不同發酵時間的大曲據其PLFA種類的相似性或差異性的大小在樹冠處形成不同水平上的連接或分枝。聚合水平＞10時,不同發酵時間的大曲可分為4組,發現這4組的分類與主成分分析結果一致的。從聚類分析和系統發育分析結果來看，發酵9 d和20 d的聚在一起，而其大曲PLFA的成分與其他的發酵曲樣的PLFA成分相距較遠，也可以從側面反映出9 d和20 d的翻曲是高溫大曲制備過程中的關鍵點。

圖4　不同發酵時間的高溫大曲的PLFA聚類分析圖

圖5　不同發酵時間的高溫大曲的PLFA系統發育分析圖

芝麻香型高溫大曲整個制備過程中，PLFA含量呈波浪形變化，發酵第20天和第25天PLFA含量達到峰值，表明這兩個時間點的大曲中生物量最為豐富，而PLFA含量最低點恰好出現在發酵第23天，即2次翻曲中間，可見翻曲對高溫大曲生物量的重要影響，因此翻曲是高溫大曲制備過程中最為關鍵的工序。此外，高溫大曲制備過程中18∶2 w6,9c、單不飽和脂肪酸、直鏈和支鏈飽和脂肪酸是發酵過程中的優勢磷脂脂肪酸（70 %～90 %），并且表現出一定的規律性。脂肪酸18:2 w6,9c和直鏈脂肪酸都呈現先減少后增加的趨勢，而支鏈飽和脂肪酸呈先增加后減少的趨勢，其中制曲的第9天（第1次翻曲）和第20天（第2次翻曲）是變化的轉折點，再次表明翻曲是高溫大曲制備過程中的關鍵點。

3　討論

通過前面PLFA的方法分析了整個大曲制曲過程中微生物群落的變化，發現發酵第9天、第20天、第25天和第36天是4次翻曲過程中微生物群落數量或者是種類都會有明顯的不同，這是由于在翻曲時，會使大曲的內部生長環境發生變化，最容易使大曲中的微生物群落發生改變，從而使檢測出來的磷脂脂肪酸的數量和種類也發生變化，從檢測結果看也正說明了這一點，而其他時間點的微生物菌落相對比較穩定。由于翻曲的變化會造成微生物供氧量增加，這樣會使真核生物、真菌和好氧菌大量生長，發酵20 d及25 d時，從檢測數據來看雖然真菌的相對豐度是下降的，但是絕對數量卻是上升的，而真核生物及好氧菌相對豐度是上升的，絕對數量更是上升的。

此次研究主要采用了PLFA方法，顯而易見PLFA方法在分析環境微生物中有許多優勢,但也存在著不足之處，這就導致本次用PLFA方法來分析高溫大曲中的微生物也存在一些不足[21]：(1)由于并不知道大曲中所有微生物的特征脂肪酸,因此在許多情況下,大曲中存在的某種特殊脂肪酸無法與大曲中特定種類的微生物相對應,因而,磷脂脂肪酸分析方法不能對微生物在種或菌株水平上加以區分；(2)該分析方法在很大程度上依賴于標記脂肪酸來確定大曲微生物群落結構,因而標記上的變動將導致群落估算上的偏差；(3)細菌和真菌能夠產生大量不同類型的磷脂脂肪酸,因而生長條件的改變或環境脅迫都能導致脂肪酸類型的改變。

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白云邊在荊州連獲兩項殊榮

本刊訊：2016年2月15日，湖北省荊州市工業經濟、招商引資暨安全生產工作會議召開。湖北白云邊酒業股份有限公司摘得“2015年度全市工業經濟稅收貢獻十強”“2015年度全市安全生產工作先進單位”兩項殊榮，受到荊州市政府通報表彰。

2015年，面對宏觀經濟持續下行、白酒市場深度調整的壓力，白云邊始終堅持穩中求進、做真做實不動搖，按照年初確定的“強基礎、補短板、提質效、增后勁”工作方針，以市場為導向，加強綜合協調，搶抓旺季增量，克難攻堅，逆勢而進，勝利完成全年經營目標。全年上交稅金8.06億元，比上年增長13.68 %，增長額近1個億，連續八年雄居荊州市工業企業納稅第一。2015年，白云邊以貫徹執行新《安全生產法》為主線，以安全隱患排查與治理為重點，以防范和遏制重特大事故發生為目標，堅持“安全第一，預防為主，綜合治理”的方針，層層落實安全生產責任制，健全安全生產標準化管理體系，有效保障了公司生產安全平穩運行。通過塑造安全生產文化，提高員工安全意識，職工安全理念開始從“要我安全”到“我要安全”轉變，推進企業安全生產達到了一個新水平。（王小波）

Phospholipid Fatty Acid Analysis (PLFA) of the Dynamic Change of Microbial Communities in the Production Process of High-temperature Daqu for Zhimaxiang Baijiu

CAO Yu1, ZHAI Lei1，XIN Chunhui2，XU Ling2，YAO Su1and CHENG Chi1
（1.China Center of Industrial Culture Collection,National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027; 2.Shandong Bandaojing Co.Ltd., Zibo, Shandong 256300, China)

Abstract:High-temperature Daqu is the typical saccharifying agent of Zhimaxiang Baijiu. It plays an important role in traditional Baijiu production by providing rich microbial species, varieties of biological enzymes, and multiple flavoring precursor substances. In this study, PLFA was applied to investigate the dynamic change of microbial biomass and community structure in the production process of Zhimaxiang hightemperature Daqu. The results sowed that, fungi were dominant in the whole Daqu-making process, and the biomass and species of bacteria presented regular change rules in the 1st and the 2nd Daqu-turning process. It can be inferred that the 1st and the 2nd Daqu-turning played key roles in Daqu-making.

Key words:Zhimaxiang Baijiu; high-temperature Daqu; PLFA; microbial community

通訊作者：程池（1962-），教授級高級工程師，博士生導師。

作者簡介：曹宇（1982-），男，湖北黃岡人，助理工程師，碩士。

收稿日期：2015-10-12

DOI：10.13746/j.njkj.2015398

中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TQ925.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）03-0033-04

優先數字出版時間：2016-02-15；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160215.1438.001.html。