海藻酸鈉/CaCO3醫用封閉劑凝膠化時間的調控

吳國華, 張　恒, 紀曉寰, 華艷萍, 孫　賓, 王　煒, 邢　程

(1. 東華大學 a. 纖維材料改性國家重點實驗室; b. 材料科學與工程學院; c. 化學化工與生物工程學院;

d. 生態紡織教育部重點實驗室, 上海 201620； 2. 蘇州安德佳生物科技有限公司， 江蘇 蘇州 215123)

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海藻酸鈉/CaCO3醫用封閉劑凝膠化時間的調控

吳國華1a, 1c, 張恒2, 紀曉寰1a, 1b, 華艷萍1a, 1b, 孫賓1a, 1b, 王煒1c, 1d, 邢程2

(1. 東華大學 a. 纖維材料改性國家重點實驗室; b. 材料科學與工程學院; c. 化學化工與生物工程學院;

d. 生態紡織教育部重點實驗室, 上海 201620； 2. 蘇州安德佳生物科技有限公司， 江蘇 蘇州 215123)

摘要：采用4種典型碳酸鈣(微米碳酸鈣、納米碳酸鈣、輕質碳酸鈣和重質碳酸鈣)，分別與葡萄糖酸內酯(GDL)組成鈣離子釋放體系，使海藻酸鈉水溶液可控凝膠化，研究了碳酸鈣與海藻酸鈉羧酸根的摩爾比(f)、GDL與碳酸鈣的摩爾比(n)和海藻酸鈉質量分數(c)對海藻酸鈉水凝膠的凝膠化時間及力學性能的影響．研究結果表明：在溫度為37 ℃, f值為0.8、 n值為1.4、 c值為2.0%時，輕質碳酸鈣體系的凝膠化時間為2.5 min，且形成凝膠的抗壓強度為0.145 MPa，因而該凝膠具備一定的力學性能，可作為醫用封閉劑的基體．

關鍵詞：海藻酸鈉； 碳酸鈣； 凝膠化時間； 力學性能； 醫用封閉劑

縫線止血會導致手術中的血流失量增多和縫合時間延長，而醫用封閉劑的使用不僅可以有效減少手術中的血流失量，而且其較快的固化速度給手術帶來了方便[1]．理想的止血封閉劑必須滿足以下條件：與組織相容性好，能被機體代謝或生物降解，無異物殘留；有一定的黏性和流動性，能暫時黏接或阻止吻合口兩端緣的分離；能迅速潤濕和填充吻合口的裂隙；常溫下，能迅速成膜、固化，形成不溶于水的膜狀物，從而有效阻隔、降低膠體毒性[2-3]．

目前的醫用止血封閉劑有纖維蛋白膠[4]、α- 氰基丙烯酸酯類[5]、明膠[6-7]、殼聚糖[8]，以及使用得較多的海藻酸鹽凝膠類[9-13]．雖然這些封閉劑已經得到廣泛的應用，但都存在一些問題.如纖維蛋白膠容易被肺組織吸收，無法實現長久的肺漏氣封閉，而且纖維蛋白膠醫用密封劑與肺組織結合過于強烈，導致肺的活動受限制[4]；α- 氰基丙烯酸酯類作為醫用黏合劑具有獨特的優點，但是其對生物組織有異反應、與組織黏結不牢固也易使組織老化[14]；明膠使用甲醛和戊二醛為交聯劑，毒性較大，難以在手術中使用；殼聚糖成膜需要用冰醋酸，冰醋酸對機體有很強的刺激性和毒性[8]．而由海藻酸鈉(SA)制備的封閉劑優點突出，SA是來自海藻的天然高分子，少量CaCl2對生物體的影響也不大[10-11]，故該類封閉劑的生物相容性好；SA有很好的水溶性，其溶液有一定的流動性和黏性，與CaCl2溶液混合后即能凝膠化，制備方法簡單且使用簡便；凝膠化形成的膜不溶于水，在水中浸泡24 h后，膜仍能保存完好，故有較好的封閉性．但這類封閉劑的缺點是SA溶液與CaCl2反應速率較快，導致形成的凝膠不均勻，影響其封閉性能，從而提高了對手術操作的要求．采用CaCO3/葡萄糖酸內酯(GDL)作為復合離子交聯體系制備海藻酸鹽水凝膠，通過GDL水解緩慢釋放H+，使Ca2+緩慢釋放出來與海藻酸鈉分子交聯形成結構均一的水凝膠，可避免海藻酸鈣快速反應而造成的凝膠結構不均勻性[15]．文獻[15]選用平均粒徑為20 μm 的CaCO3做鈣源，凝膠化時間大于8 min.

較短的凝膠化時間有利于臨床手術，為此，本文選用4種典型的CaCO3，即微米碳酸鈣、納米碳酸鈣、輕質碳酸鈣和重質碳酸鈣，分別與GDL結合作為鈣離子緩釋體系，研究CaCO3與海藻酸鈉羧酸根的摩爾比(f)、GDL與CaCO3的摩爾比(n)和海藻酸鈉的質量分數(c)對海藻酸鹽水凝膠的凝膠化時間及力學性能的影響，以達到調控凝膠化時間的目的，為海藻酸鈉水凝膠的制備奠定基礎.

1試驗

1.1原料

海藻酸鈉，黏度(10 g/L, 20 ℃)≥0.02 Pa·s，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；微米碳酸鈣，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；納米碳酸鈣，分析純，上海躍江鈦白化工制品有限公司；輕質碳酸鈣，分析純，上海躍江鈦白化工制品有限公司；重質碳酸鈣，分析純，上海聚千化工有限公司；GDL，分析純，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司．

1.2海藻酸鹽水凝膠的制備

海藻酸鹽水凝膠的制備過程如圖1所示．將一定質量的CaCO3微粒加入海藻酸鈉溶液中，超聲分散均勻后，往其中加入GDL，迅速攪拌混合均勻后將混合液倒入24孔細胞培養板(孔直徑d=2 cm)中，混合溶液經一定時間后形成凝膠．

圖1　海藻酸鹽水凝膠制備過程示意圖Fig.1　Schematic illustration of the preparation 　process of alginate hydrogel

1.3凝膠的結構與性能測試

1.3.1海藻酸鈉溶液黏度

用美國BROOKFIELD公司生產的R/S-Plus型計算機控制黏度儀測試不同含量的海藻酸鈉溶液的表觀黏度(動力黏度)，采用高黏度的短套筒，溫度為37 ℃．設定程序：第一階段(前100 s)，剪切速率從0 s-1升至800 s-1；第二階段(后100 s)，剪切速率保持800 s-1．

1.3.2凝膠化時間

采用試管傾斜法在37 ℃(水浴)下測定樣品的凝膠化時間．每隔30 s傾斜盛裝有10 mL凝膠樣品的試管，直至樣品停止流動，記錄所需時間．

1.3.3CaCO3顆粒的形貌尺寸及其在海藻酸鈉復合膜中的分散性

將4種CaCO3分別超聲分散在去離子水中，然后滴加到鋁箔紙上并烘干，用日本JSM-5600 LV型掃描電子顯微鏡(SEM)拍攝CaCO3顆粒形態．

分別將0.2 g微米碳酸鈣、納米碳酸鈣、輕質碳酸鈣和重質碳酸鈣添加至50 g質量分數為2%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻，超聲分散1 h后，將混合液分別放入表面積相同的培養皿中，置于60 ℃烘箱中烘干成膜．用Nikon公司生產的ALPHAPHOT-2 YS2型雙目生物顯微鏡放大100倍拍照片，對共混膜的表面進行表征．

1.3.4凝膠力學性能

將凝膠化24 h后得到的凝膠樣品，用長春科新實驗儀器公司生產的20KNWDW 3020型萬能材料試驗機測試樣品的抗壓強度．加載速度為2 mm/min， 每組樣品平行測定5次，取平均值．

2試驗結果與討論

2.1海藻酸鈉溶液流變性

海藻酸鈉的質量分數是決定其凝膠化能力和溶液流動性的關鍵因素．在稀溶液下，海藻酸鈉分子鏈處于分離狀態，難以凝膠化；而溶液濃度過高，其流動性變差，會給后續操作，包括與其他試劑的混合和手術操作帶來不便和困難．為此，本文首先研究了海藻酸鈉溶液黏度隨其質量分數的變化，進而得到其臨界質量分數，為凝膠化調控提供基礎.

溫度精確控制在37 ℃，測定不同質量分數(0.1%, 0.2%, 0.5%, 0.8%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 4.0%, 5.0%)的海藻酸鈉溶液的表觀黏度隨剪切速率的變化，結果如圖2所示. 由圖2可知，海藻酸鈉溶液的表觀黏度對其質量分數具有依賴性，即海藻酸鈉溶液的黏度隨質量分數的升高而增大．這是由于海藻酸鈉大分子間相互接觸，彼此間鏈段纏結，分子間范德華力以及氫鍵作用等導致海藻酸鈉溶液黏度增大．

圖2　不同質量分數海藻酸鈉溶液的表觀黏度曲線Fig.2　Curves of apparent viscosity of sodium alginate 　solution with different mass fractions

基于圖2的數據，得到37 ℃時海藻酸鈉溶液的黏度(剪切速率為50 s-1時)與海藻酸鈉質量分數的對數關系，結果如圖3所示．

圖3　海藻酸鈉溶液的黏度與海藻酸鈉質量分數的對數關系

Fig.3The logarithmic relationship between the viscosity of the sodium alginate solution and the mass fraction of sodium alginate

由圖3可知，當海藻酸鈉質量分數較小時，lgη-lgc呈現曲線變化關系；當質量分數增加到某一值時，lgη-lgc呈現線性關系，這時聚合物開始相互穿插交疊，該質量分數稱為臨界質量分數c*.低于臨界質量分數c*時，海藻酸鈉分子在溶液中是分離的，表現出低黏度；而當高于臨界質量分數c*時，海藻酸鈉大分子互現穿插，分子之間范德華力以及氫鍵作用等導致海藻酸鈉溶液黏度急劇增大[16-17]．對圖3中較高質量分數時的lgη-lgc進行線性擬合，質量分數為1.5%(lg 1.5=0.18)時其相關系數R2僅為0.9849，而質量分數為2.0%(lg 2.0=0.30)時的相關系數R2達0.9939，說明質量分數大于2.0%時lgη-lgc呈現線性關系，所以選定海藻酸鈉的臨界質量分數c*為2.0%.在臨界質量分數下海藻酸鈉溶液的流動性適當，且分子鏈間已存在一定的相互作用，易于形成一定強度的凝膠，故本文在海藻酸鈉質量分數為2.0%條件下進行后續的凝膠化時間調控．

2.2CaCO3的形貌尺寸及其在海藻酸鈉基體中的分散性

CaCO3的形貌尺寸、密度及其在海藻酸鈉基體中的分布狀態，影響其與GDL反應釋放Ca2+的速度，從而影響凝膠化時間和凝膠的性能．本文采用掃描電子顯微鏡對4種CaCO3進行了觀察，結果如圖4所示．由圖4可見，微米碳酸鈣(圖4(a))和納米碳酸鈣(圖4(b))顆粒平均粒徑分別約為20 和1 μm．其中，納米碳酸鈣呈團聚體粒子形貌，團聚后顆粒屬于微米級粒子，每個顆粒都是由很多初級粒子團聚而成，團聚后顆粒不夠規則．輕質碳酸鈣(圖4(c))及重質碳酸鈣(圖4(d))顆粒平均粒徑分別為2 和5 μm左右，前者由化學反應制得，顆?；境拾羟驙?，后者由機械粉碎方法制得，顆粒形狀不規則.

(a) 微米碳酸鈣　(b) 納米碳酸鈣

(c) 輕質碳酸鈣　(d) 重質碳酸鈣

由4種CaCO3與海藻酸鈉的復合溶液分別制備共混膜，通過雙目生物顯微鏡放大100倍拍照片觀察CaCO3微粒在膜表面的分布，結果如圖5所示．

(a) 微米碳酸鈣　(b) 納米碳酸鈣

(c) 輕質碳酸鈣　(d) 重質碳酸鈣

由圖5可見，4種CaCO3均呈現出形貌明顯可分辨的顆粒，其中，重質、輕質和納米碳酸鈣基本未見較大的顆粒團聚體，分布狀況均較微米碳酸鈣好.這表明除微米碳酸鈣因顆粒較大在溶液復合制樣時較難混合均勻外，其他3種碳酸鈣原料與海藻酸鈉基體均有著較好的相容性．

2.3凝膠化時間

以上述CaCO3微粒與GDL反應釋放的Ca2+制備水凝膠，研究CaCO3與海藻酸鈉中羧酸根的摩爾比(f)、GDL和CaCO3的摩爾比(n)和海藻酸鈉質量分數(c)對凝膠化時間的影響，結果如圖6所示．

(a) c=2.0%, n=1.4

(b) c=2.0%, f=0.5

(c) n=1.4, f=0.5

Fig.6The gelation time of alginate hydrogels

由圖6可見，海藻酸鈉水凝膠的凝膠化時間隨著f值和n值的增大而減小，隨著c值的增大而增大．這是由于f值的增大使得體系單位體積中有更多的Ca2+與海藻酸鈉的羧酸鹽結合，使凝膠化過程變得容易，凝膠化時間縮短；n值的增大使單位時間內有更多的Ca2+從CaCO3微粒中釋放出，使得海藻酸鈉分子鏈與Ca2+的螯合作用更加容易，同樣使凝膠化時間縮短．而隨著海藻酸鈉質量分數逐漸增大，單位羧酸鈉可結合的Ca2+量逐漸減小，使得凝膠化時間延長. 在相同條件下，不同CaCO3制備的水凝膠凝膠化時間由短到長依次為：輕質碳酸鈣<納米碳酸鈣<重質碳酸鈣<微米碳酸鈣，其中輕質碳酸鈣作為鈣離子源的復合體系具有最短的凝膠化時間. 由圖6(a)可知，在f值為0.8、n值為1.4、c值為2.0%時，輕質碳酸鈣體系的凝膠化時間僅為2.5 min，而納米碳酸鈣體系和重質碳酸鈣體系分別為4.0和4.5 min，微米碳酸鈣則達9.5 min.試驗結果表明CaCO3密度的影響更為關鍵．輕質碳酸鈣為化學反應制得，具有更大的沉降體積且密度小[19]，分子堆砌較為松散，H+與CaCO3顆粒沿徑向的反應速率更快，在單位時間內釋放出的Ca2+可能比納米碳酸鈣更多，故盡管其顆粒尺寸比納米碳酸鈣大，但凝膠化時間更短.

2.4凝膠的力學強度

海藻酸鈉水凝膠的抗壓強度隨CaCO3與羧基的摩爾比f值、GDL與CaCO3的摩爾比n值和海藻酸鈉質量分數c的變化規律如圖7所示．

(a) c=2.0%, n=1.4

(b) c=2.0%, f=0.5

(c) n=1.4, f=0.5

Fig.7The compressive strength of alginate hydrogels

由圖7可見，同一鈣源制備的海藻酸鈉水凝膠的抗壓強度隨f值、n值和c值的增大而增大，但當f值大于0.4、n值大于1.4 和c值超過2.0%時，抗壓強度增大的趨勢均明顯減?。甪值的增大使得體系中有更多的Ca2+與海藻酸鈉分子結合，使水凝膠的凝膠化過程變得更加容易，而Ca2+含量的增大相當于交聯點增多[20]，使凝膠網絡更加致密，從而提高凝膠力學性能．n值的增大使得更多的CaCO3釋放出Ca2+，使得海藻酸鈉分子鏈與Ca2+的螯合作用更加容易，同樣使得凝膠網絡填充更加緊密，導致水凝膠體系的強度增加.海藻酸鈉質量分數的增大使得海藻酸鈉大分子之間的間距減小，海藻酸鈉分子鏈與Ca2+的螯合更加容易，同樣使得凝膠的力學性能提高．當n、f和c分別增大到一定值后，由于Ca2+與海藻酸鈉分子的凝膠化比較充分，故水凝膠力學性能增大的趨勢明顯減小．由圖7(a)可知，在f值為0.8、n值為1.4、c值為2.0%時，用納米碳酸鈣和輕質碳酸鈣分別制備的水凝膠的抗壓強度分別為0.160 MPa(50.24 N)和0.145 MPa(45.53 N)，優于以微米碳酸鈣為鈣源制備的水凝膠強度(0.125 MPa， 39.25 N)和文獻[15]報道的水凝膠強度(24 N)．

3結語

因微粒形貌尺寸和密度的差異，不同CaCO3微粒與GDL組成的Ca2+釋放體系，其海藻酸鈉水凝膠的凝膠化時間由短到長依次為輕質碳酸鈣<納米碳酸鈣<重質碳酸鈣<微米碳酸鈣．在CaCO3與海藻酸鈉中羧酸根的摩爾比f值為0.8、 GDL與CaCO3的摩爾比n值為1.4、海藻酸鈉質量分數c值為2.0%時，輕質碳酸鈣體系可形成較好力學性能的水凝膠，在37 ℃ 時其凝膠化時間為2.5 min，該凝膠可作為醫用封閉劑的基體.其與生物組織黏附能力和體內吸收周期調控的研究，將見于后續的報道.

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Tuning Gelation Time of Sodium Alginate/CaCO3Base Hydrogel for Using as Medical Sealants

WUGuo-hua1a, 1c,ZHANGHeng2,JIXiao-huan1a, 1b,HUAYan-ping1a, 1b,SUNBin1a, 1b,WANGWei1c, 1d,XINGCheng2

(a. State Key Laboratory for Modification of Chemical Fibers and Polymer Materials； b. College of Materials Science and Engineering; c. College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology; d. Key Laboratory of Science &Technology of Eco-textile, Ministry of Education, 1. Donghua University, Shanghai 201620, China； 2. EndoClot Plus Suzhou Co.Ltd., Suzhou 215123, China)

Abstract:Calcium carbonate (CaCO3) and gluconolactone (GDL) were composed together as calcium ion slow-release system. Four typical kinds of CaCO3 (micron-CaCO3, nano-CaCO3, light CaCO3 and ground CaCO3) were used as calcium source for making the gelation of sodium alginate controllable. The effects of different parameters (including the molar ratio of CaCO3 and carboxyl group (f), the molar ratio of GDL and CaCO3 (n), the mass fraction of sodium alginate solution (c)) on hydrogels’ gelation time and mechanical properties were studied. The results show that the gelation time of light CaCO3 system is about 2.5 min under the condition of 37 ℃, f valued 0.8, n valued 1.4 and c valued 2.0%, the compressive strength of the hydrogels is 0.145 MPa, they also have certain mechanical properties and can be used as the substrate of the medical sealants.

Key words:sodium alginate; calcium carbonate; gelation time; mechanical properties; medical sealants

中圖分類號：R 318.08

文獻標志碼：A

作者簡介：吳國華(1989—)， 男，江西景德鎮人，碩士研究生，研究方向為多糖功能材料的研制和應用開發．E-mail：wugh1005roy@163.com張恒(聯系人)，男，工程師，E-mail：zhangheng2009@gmail.com

收稿日期：2014-10-31

文章編號：1671-0444(2016)01-0067-06