響應曲面法優化羅伊氏乳桿菌發酵培養基

秦 鵬，謝 鵬，劉廣宇，梁宏基，梁淑娃， 黃葵英　(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

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響應曲面法優化羅伊氏乳桿菌發酵培養基

秦 鵬，謝 鵬，劉廣宇，梁宏基，梁淑娃*， 黃葵英(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

摘要[目的]優化羅伊氏乳桿菌發酵培養基，提高該菌發酵活菌數。[方法]采用Plackett-Burman以及響應曲面法對羅伊氏乳桿菌發酵培養基進行研究，確定羅伊氏乳桿菌發酵培養基中顯著影響發酵活菌數的因素，并通過響應曲面法進行優化，以確定最優發酵培養基組分。[結果]試驗表明，所得二次回歸模型達到極顯著水平，無失擬因素存在。優化后的羅伊氏乳桿菌發酵培養基組成為：葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，在此條件下發酵液活菌數可以達到8.25×109 CFU/mL。[結論]研究證實了響應曲面法可用于優化提高羅伊氏乳桿菌發酵活菌數，為其工業化生產奠定了基礎。

關鍵詞羅伊氏乳酸菌；Plackett-Burman設計；響應曲面法

Optimization of Fermentation Medium ofLactobacillusreuteriby Response Surface Methodology

QIN Peng, XIE Peng, LIU Guang-yu, LIANG Shu-wa*et al

(Guangzhou Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510663)

Abstract[Objective] To increase the viable count of submerged fermentation ofLactobacillusreuteri. [Method] Plackett-Burman design and response surface methodology were used to investigate the fermentation medium ofL.reuteri. Factors significantly affected the viable count ofL.reuteriwere detected in fermentation medium. Optimization was carried out by response surface method. The combination of optimal fermentation medium was detected. [Result] The second-order regression models reached extremely significant level without the lack of fit. The optimized culture medium was 3.09% glucose, 4.19% yeast extract powder and 10.03% fruit and vegetable juice. Under this condition, the viable count of fermentation broth was 8.25×109CFU/mL. [Conclusion] Response surface method is suitable for the enhancement of viable count ofL.reuterifermentation broth, and lays foundation for the industrialized production.

Key wordsLactobacillusreuteri; Plackett-Burman design；Response surface method

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是普遍存在于人類和大部分動物腸道中的益生菌，它可以代謝產生有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素及類細菌素等物質[1-2]，不僅能夠調節胃腸道健康，還具有增強免疫力、抗腫瘤、抗癌變及抗衰老等多種功能[3-4]。然而目前，較低的發酵水平制約了羅伊氏乳桿菌的進一步擴大應用。

響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優化工藝條件的有效方法，中心組合設計(CCD)可用于確定試驗因素及其交互作用對指標響應值的影響，精確表述因素和響應值之間的關系[5]。響應面分析法具有試驗次數少、周期短，求得的回歸方程精確度高等優點，可以研究幾個因素的交互作用，是降低生產成本、優化培養條件的一種有效方法，近年來逐漸受到重視，并成功運用到農業、生物、食品等領域[6]。

筆者使用Plackett-Burman設計，對發酵培養基中影響發酵液活菌數的顯著因子進行篩選；然后使用響應面分析法，對發酵培養基中的葡萄糖、酵母粉和果蔬汁3種顯著影響發酵液活菌數的因素進行優化，以提高羅伊氏乳桿菌發酵液中的活菌數，為后續工業化擴大生產奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及原料。供試菌種為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，廣州市微生物研究所保藏；果蔬汁， 北京匯源食品飲料有限公司。

1.1.2培養基。種子培養基：蛋白胨 1.0%，牛肉膏 1.0%，酵母粉0.5%，葡萄糖 2.0%，磷酸氫二鉀 0.2%，檸檬酸氫二銨 0.2%，乙酸鈉 0.5%，硫酸鎂 0.058%，pH 6.2～6.4。

發酵培養基：葡萄糖3.5%，酵母粉2.0%，果蔬汁10.0%，磷酸氫二鉀 0.2%，檸檬酸氫二銨 0.2%，乙酸鈉 1.0%，pH 6.0。

1.2培養方法將羅伊氏乳桿菌凍存保管，接種于種子培養基，37 ℃厭氧靜置培養 18～24 h，待活菌數達 1×108CFU/mL時，按 2%接種量接種于發酵培養基，37 ℃厭氧培養 24 h 后，使用微生物計數方法，對發酵液計數。

1.3測定方法及計算采用稀釋倒平板法，具體原理和步驟參考GB 4789-2010 中乳酸菌菌落總數的測定方法[7]。

1.4關鍵因素篩選試驗使用Minitab軟件，對發酵培養基的7個因素進行Plackett-Burman組合設計。每個變量設高低2個水平，響應值為發酵液活菌數(Y)，共進行12次試驗，考察各個因素的主效應和交互效應的一級作用，從中篩選出對發酵液活菌數具有顯著作用的3個因素。Plackett-Burman設計中各個因素水平及編碼見表1。

1.5培養基優化根據Plackett-Burman試驗的結果，選取葡萄糖、酵母粉和果蔬汁這3個因子作為研究對象，進行響應面試驗，以發酵液活菌數(Y)作為試驗的響應值，使用Design expert 7.5進行試驗設計與數據分析。中心組合試驗實際的因素水平以及編碼見表2 。

2結果與分析

表1　Plackett-Burman設計因素水平及編碼

表2　培養基參數水平編碼

表3　Plackett-Burman試驗以及試驗結果

表4　Plackett-Burman試驗方差分析

使用Design expert 7.5軟件對數據進行分析，得到的編碼方程為Y=6.970+1.354×A+0.915×B-0.272×C-0.005×A×B-0.005×A×C+0.245×B×C-0.619×A2-0.384×B2-0.512×C2。使用Design expert 7.5軟件進行尋優，得到最優化條件為葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，此時預測的響應值(發酵液活菌數)可達8.25×109CFU/mL。

從以上分析可知，因素B(酵母粉)和C(果蔬汁)的交互作用對羅伊氏乳桿菌發酵液中的活菌數影響顯著(P=0.000 4<0.05)。這說明在培養基中添加一定量的果蔬汁、酵母粉等富含氨基酸維生素的物質，可以促進羅伊氏乳桿菌的生長，這也從側面說明了羅伊氏乳桿菌是異養菌，為使菌體增殖，獲得更高的發酵活菌數，必須添加生長因子；但過量的營養物質會引起滲透壓升高等不利因素，抑制菌體的增殖，并且造成資源的浪費。

表5　中心組合試驗及結果

圖1　酵母粉與果蔬汁的交互作用Fig.1　Interaction between yeast extract powder and the fruit and vegetable juice

圖2　葡萄糖與酵母粉交互作用Fig.2　Interaction between glucose and yeast extract powder

由3組交互作用圖(圖1～3)可以看出，響應曲面呈傘形，中心突起，說明兩因素之間的影響基本呈拋物線型關系，均有一個極大值點，變化趨勢都是先增大后減小，即存在適宜的葡萄糖、酵母粉和果蔬汁的濃度使羅伊氏乳桿菌發酵液中的活菌數達到最高。

圖3　葡萄糖與果蔬汁交互作用Fig.3　Interaction between glucose and the fruit and vegetable juice

2.3驗證試驗為驗證預測值與真實值之間的擬合程度，使用上述優化條件在搖瓶水平上進行了重復驗證試驗：葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、 果蔬汁10.03%，pH 6.0，試驗共進行3組(詳細結果見表6)，平均活菌數8.28×109CFU/mL，與預測值擬合性良好，較優化前提高28.40%。

表6　驗證試驗結果

3結論

羅伊氏乳桿菌是一種異型發酵乳酸菌，Doleyres 等分批培養羅伊氏菌獲得生物量為 1.7×109CFU/mL[8]；國內學者王志林等對羅伊氏乳桿菌發酵過程參數進行了研究優化，獲得的細胞密度達到了3.1×109CFU/mL[9]。

該研究以羅伊氏乳桿菌發酵過程中的活菌數為研究對象，使用Plackett-Burman對培養基中顯著影響發酵液活菌數的因素進行快速篩選，然后通過響應曲面法對這些因素進行研究，建立了葡萄糖、酵母粉、果蔬汁這三者與活菌數之間的關系，并實現優化。最優條件為葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，pH 6.0，發酵活菌數預測值為8.25×109CFU/mL。通過驗證試驗證實該試驗建立的模型具有實際指導意義，優化后羅伊氏乳桿菌發酵活菌數可達8.28×109CFU/mL，較優化前提高28.40%，且與模型預測值非常接

近，優于Doleyres等、王志林等的結果，可為羅伊氏乳桿菌發酵工藝的開發與優化提供研究基礎。

參考文獻

[1] 王成濤，曹雁平，孫國寶，等.產類細菌素乳酸菌的篩選及其生物學特性研究[J]．中國釀造，2008(23)：50-53.

[2] SUSAN F B，CATHERINE G N.Antibiosis revisited：bacteriocins produced by dairy starter cultures[J].Journal of dairy science，1993，76(8)：2366-2379.

[3] 熊濤，宋蘇華，黃濤，等.植物乳桿菌 NCU116 抑菌性能的研究[J]． 食品與發酵工業，2012，38(6)：97-101.

[4] TUOHY K M，PROBERT H M，SMEJKAL C W，et al． Using probiotics and prebiotics to improve gut health[J]．Drug discovery today，2003，8(15)：692-700.

[5] 韓健，劉朝輝，齊崴，等.β-甘露聚糖酶發酵液絮凝條件的統計學篩選與響應面優化[J].生物加工過程，2007，5(2)：29-34.

[6] 曹小紅，哈志瑞，王春玲，等.響應面法對BcalliusnattoTK-2產聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)發酵培養基的優化[J ].食品與發酵工業，2008(1)：24-26.

[7] 中華人民共和國衛生部.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 [S].北京：中國標準出版社，2010.

[8] DOLEYRES Y，BECK P，VOLLENWEIDER S，et al.Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process withLactobacillusreuteri[J].Applied microbiology and biotechnology，2005，68：467-474.

[9] 王志林，陳莊，廖玲，等.豬源羅伊氏乳酸桿菌培養條件優化及其凍干保護劑篩選[J].廣東農業科學，2012(19)：151-153.

中圖分類號S 188+.4

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)06-091-03

收稿日期2016-02-14

作者簡介秦鵬(1983- )，男，山東青島人，工程師，碩士，從事發酵工程研究。*通訊作者，高級工程師，從事發酵工程研究。

基金項目廣東省協同創新與平臺環境建設專項項目(2015B0404-03004)。