cDNA-AFLP分析不同發育時期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達的關鍵技術

陳曉鳳，黃鳳蘭*，趙 永，姜桐桐，李佳會，周婷婷，常旭豐，劉佳琪

(1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2.內蒙古自治區高校蓖麻產業技術研究中心，內蒙古通遼 028000；3.內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室，內蒙古通遼 028000)

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cDNA-AFLP分析不同發育時期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達的關鍵技術

陳曉鳳1，2，3，黃鳳蘭1，2，3*，趙 永1，2，3，姜桐桐1，2，3，李佳會1，2，周婷婷1，常旭豐1，劉佳琪1

(1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2.內蒙古自治區高校蓖麻產業技術研究中心，內蒙古通遼 028000；3.內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室，內蒙古通遼 028000)

摘要在介紹cDNA-AFLP技術原理與操作步驟的基礎上，分析了應用cDNA-AFLP分子標記技術分析蓖麻種子脂肪酸含量差異基因表達過程中的主要影響因素，以期為后續利用該標記技術分析不同發育時期蓖麻種子脂肪酸含量的差異表達提供技術支持。

關鍵詞cDNA-AFLP；蓖麻；差異基因表達

cDNA-AFLP Analysis of Key Technique on Various Gene Expressions of Different Developmental Time Castor Seed Fatty Acid

CHEN Xiao-feng1,2,3, HUANG Feng-lan1,2,3*, ZHAO Yong1,2,3et al

(1. College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028000; 2. The Inner Mongolia Autonomous Region University Castor Industry Technology Research Center, Tongliao, Inner Mongolia 028000; 3. Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding,Tongliao, Inner Mongolia 028000)

AbstractBased on introducing principle and operation steps of cDNA-AFLP technology, the key influencing factors of using cDNA-AFLP molecular marker technology in gene expression research process of different fatty acid content in castor seed were analyzed, so as to provide technical support for subsequent researches on using this molecular maker technology in anslysis of different fatty acid content in different developmental time castor seed.

Key wordscDNA-AFLP; Castor; Differential gene expression

蓖麻(Ricinusconununis)為大戟科蓖麻屬雙子葉植物，是一種重要的油料作物[1]，其適應范圍廣，綜合利用價值高，廣泛應用于醫藥、化工、機械、航空航天等行業。蓖麻種子脂肪酸含量較高，種仁中油脂含量高達60%～70%，提高種子含油率具有重要的實踐意義[2-6]。

cDNA-AFLP技術是基于AFLP技術建立起來的，與RT-PCR技術結合后用于分析mRNA表達情況，具有靈敏性高、假陽性率低等優點，可顯著標注基因差異表達，最大限度地提供基因編碼區不同性狀的差異信息。因此，掌握該技術的原理和實際操作過程中的關鍵步驟，有助于研究蓖麻種子脂肪酸含量的差異表達。筆者介紹了應用cDNA-AFLP分子標記技術分析蓖麻種子脂肪酸差異基因表達研究過程中的主要影響因素，以期為后續利用該標記技術分析不同發育時期蓖麻種子脂肪酸含量的差異表達提供技術支持。

1cDNA-AFLP技術原理與操作步驟

AFLP標記技術是一種限制性選擇PCR擴增基因片段的方法，即建立mRNA差異顯示技術。高等生物成熟時，mRNA具有特異的polyA結構特征，分離、純化mRNA后與專一的錨定引物反轉錄cDNA，再結合AFLP技術對其進行選擇性擴增，以達到差異基因的分離[7]。mRNA差異顯示技術不僅保留了AFLP技術的諸多優點，且具有重復性好、準確性高、效率更加顯著等優點，可對生物體轉錄組進行更加全面、系統的分析，能反映基因間表達量的差異[8]。根據起始材料的不同分為DNA-AFLP、cDNA-AFLP。cDNA-AFLP技術已成功用于分析特異表達基因雜種優勢遺傳機理的研究、表達基因的遺傳連鎖作圖、基因功能標記分析、基因表達特性研究等方面[9-10]。

cDNA-AFLP技術第一步是獲得高質量的試驗材料，第二步是利用雙高頻限制性內切酶酶切基因組或RNA，第三步是酶切產物與人工合成特定序列的雙鏈接頭連接，第四步是以加錨2～3個特異選擇性堿基的引物對連接產物進行選擇性PCR擴增，最后一步是電泳分離差異表達基因。在整個研究過程中，所加錨的堿基種類、數目或順序決定了PCR擴增產物的特異性，僅有接頭側翼堿基與所加錨的幾個選擇性堿基相匹配的基因片段，才符合被擴增要求，根據該特點可設計特異性引物，能最大程度地滿足試驗要求(圖1)。

圖1　cDNA-AFLP技術流程Fig.1　The technical process of cDNA-AFLP

2cDNA-AFLP技術分析不同發育時期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達的操作要點

2.1蓖麻種子總RNA的提取高質量總RNA的提取以及其完整性，是該試驗的關鍵性問題之一。實驗室常用的提取方法有CTAB法和TRIZOL法。但這2種方法在提取過程中常導致RNA中出現雜質而降低純度。不同發育時期蓖麻種子脂肪酸差異基因表達研究中使用北京莊盟公司生產的植物總RNA提取試劑盒，是廣譜型RNA提取試劑盒，該試劑盒克服了上述缺點，具有成本較低、操作快速、提取時分層及顏色對比明顯的特點，且不易受多糖、酚類等物質的影響，保證了RNA的完整性及純度(圖2)。

圖2　植物總RNA提取試劑盒提取蓖麻種子總RNAFig.2　Total RNA of castor seed extracted by plant total RNA extraction kit

2.2cDNA合成質量與雙酶切對擴增效果的影響cDNA合成過程中，由于多糖、酚、酮類化合物的存在，或是頻繁過度的高速離心等操作過程都會導致一些遺傳序列信息的丟失；也有可能是轉錄過程中并不是全部的表達信息進行翻譯，造成部分低豐度基因的損失。該研究雙鏈cDNA的合成采用的是TaKaRa的合成體系，可獲得高質量、高濃度的片段，降低了因基因丟失對下一步試驗的影響。

cDNA-AFLP技術中，雙內切酶組合的選擇至關重要，一般采用雙酶切組合，且其組合應最大限度地覆蓋基因池，酶切時間要適中，連接酶要高效，產物片段能夠順利地與接頭進行連接，避免酶切片段間自連而產生假象，保證酶切完全、徹底(圖3)。

圖3　cDNA酶切結果Fig.3　The result of restriction enzyme digestion of cDNA

2.3cDNA-AFLP技術兩步PCR擴增擴增引物的選擇是PCR成功的關鍵，也是cDNA-AFLP技術整個試驗過程成敗的關鍵因素之一，引物長度在15～20 bp大小為宜，引物3′端選擇性堿基數目、種類決定擴增的特異性。而選擇性堿基的G、C含量對擴增產物的數目也有影響，G+C含量在40%～60%為宜，尤其引物內部在3′端最好不產生二級結構。

在PCR擴增體系和程序中，模板濃度對體系穩定性影響較大，合適的稀釋倍數是擴增成功的關鍵。稀釋倍數較小，引物或dNTP會很快被耗盡，遺傳信息不能夠得到完全復制，影響其完整性，且在電泳時會出現嚴重的拖尾現象；稀釋倍數過大，低濃度的模板會導致擴增效果不明顯甚至難以檢測到，電泳中未見條帶或者條帶模糊不清，從而造成遺傳信息丟失，不利于后續試驗對基因差異的檢測、分離。

2.4cDNA-AFLP反應體系、反應程序的優化分別對種子總RNA的提取、雙酶切時間、預擴增、選擇性擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳條件進行了優化，建立了適于分析蓖麻種子中脂肪酸含量差異基因表達的cDNA-AFLP技術體系。第一，RNA的提取必須在無菌環境即超凈工作臺內進行，操作人員須佩戴口罩，防止口腔內各種酶干擾提取過程，操作過程中盡可能減少人員流動；第二，因該研究對雙酶切的要求是同時具有2個必要的限制性內切酶識別位點，因此對于酶的選擇至關重要，MseI/EcoRI的酶切組合均是高頻限制性的，可最大可能地覆蓋基因片段，產生更廣的酶切結果，有利于后續擴增得到更多更特異性的基因；第三，預擴增、選擇性擴增是得到差異片段的中間環節，因此，最合適的體系與程序相結合很關鍵，利用五五均勻設計法優化，得到最佳的反應程序與體系；第四，分離差異基因的最后一步是聚丙烯酰胺凝膠電泳，該步驟耗時較長，整個試驗過程的費用較高，因此要注意凝膠時間、電壓大小和時間長短、銀染程度等因素。

圖4　cDNA-AFLP分析蓖麻種子脂肪酸差異表達基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果Fig.4　cDNA-AFLP analysis of polyacrylamdide gel of various gene expressions of castor seed fatty acid

2.5聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，膠體的凝聚程度，電泳的電壓大小、時間長短，染液的濃度，固定、銀染、顯影的時間以及顯色程度等都能夠影響差異基因的篩選。親和硅烷和剝離硅烷的滴加量要適當，當聚丙烯酰胺凝膠凝聚不完全或凝聚過久，會在剝離膠板時出現破碎等現象；電壓過高會使條帶不明亮、基因信息跑出膠板導致丟失，電壓過低則會導致電泳時間過長從而分離效果不明顯，所需基因信息降解以致于不能得到完全分離；銀染全過

程必須使用ddH2O，否則混雜的其他離子會嚴重影響銀離子染色及顯色效果；顯色液必須現配現用，顯色時必須加甲醛且不能提前加。cDNA-AFLP分析蓖麻種子脂肪酸差異表達基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳效果見圖4。

3展望

cDNA- AFLP技術反應條件雖然嚴謹，但卻能集中顯示基因組表達序列的多態性差異，對mRNA的轉錄均等擴增，可有效地找到目的基因。研究轉錄水平基因表達的目的之一是分離該基因并進一步研究該基因的功能和對生物個體發育的影響，cDNA-AFLP 和dd-PCR的結合更適合差異基因的分離，已逐漸成為基因表達模式研究的有效手段之一，也是研究功能基因組的新方法、新手段，并已顯示出巨大的應用潛能。cDNA-AFLP技術必將在全面了解基因表達和后基因組計劃中發揮巨大作用。

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中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)06-177-02

收稿日期2016-01-28

作者簡介陳曉鳳(1990- )，女，內蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：蓖麻分子育種。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事蓖麻分子育種研究。

基金項目內蒙古民族大學研究生科研資助項目(NMDSS1467)；國家自然科學基金項目(30760123，31160290，31460353)；內蒙古自治區高等學校“青年科技英才支持計劃”(NJYT-14-A10)；內蒙古自治區科技創新引導項目；內蒙古自治區“草原英才” 計劃項目；市校合作項目(SXZD2012018，SXZD2012017，SXZD2012006)。