茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白含量及其與土壤因子的關系

高秀兵，邢丹，陳瑤，周富裕，趙華富，陳娟，郭燦，周玉鋒*.貴州省農業科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；.貴州省農業科學院辣椒研究所，貴州 貴陽 550006

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茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白含量及其與土壤因子的關系

高秀兵1，邢丹2，陳瑤1，周富裕1，趙華富1，陳娟1，郭燦1，周玉鋒1*
1.貴州省農業科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農業科學院辣椒研究所，貴州 貴陽 550006

摘要：球囊霉素相關土壤蛋白（Glomalin-related soil protein，GRSP）是由叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）產生的一種含金屬離子的糖蛋白，對維護AMF本身的生理功能以及保持土壤有機碳平衡和土壤團聚體穩定性極為重要。于貴州4個重點茶區（湄潭縣、石阡縣、貴定縣和都勻市）茶園采集茶樹根際土樣，采用Bradford法測定茶樹根際GRSP，并分析土樣的基本理化性質，以了解茶樹根際GRSP含量及其與土壤因子的關系。結果表明，茶樹根際土壤總GRSP（Total glomalin-related soil protein，T-GRSP）和易提取GRSP （Easily extractable glomalin-related soil protein，EE-GRSP）含量因茶樹品種、種植區域不同而各異，總體含量分別在5.71～22.84 mg·g(-1)和2.35～7.91 mg·g(-1)間，均值分別為12.96 mg·g(-1)和4.88 mg·g(-1)。相關性分析發現，T-GRSP與水解氮（Hydrolysable nitrogen，Nh）、速效鉀（Available potassium，Ka）和有機質（Organic matter，OM）含量極顯著正相關；EE-GRSP與Nh、Ka和OM含量極顯著正相關，與土壤pH值顯著負相關。多元線性回歸方程表明，不同土壤因子對GRSP的貢獻不同，對于T-GRSP的貢獻，水解氮＞速效磷＞有機質；對于EE-GRSP的貢獻，水解氮＞速效磷。可見，茶樹根際GRSP含量豐富，它與土壤因子有密切關系，可通過了解GRSP的含量來評價茶樹根際土壤質量。

關鍵詞：茶樹；叢枝菌根真菌；球囊霉素相關土壤蛋白；土壤因子

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）是一類廣泛分布于陸地生態系統中的有益土壤微生物，它與宿主植物形成的叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）結構具有改善宿主植物對磷、鋅、鈣等多種礦質元素和水分的吸收和利用、促進宿主植物生長、改善作物品質等多種功能[1-4]，因此，AMF在植物生長，群落的結構組成、演替和穩定性，植物多樣性的形成，退化生態系統的植被恢復等方面具有重要的生態學意義。

球囊霉素（Glomalin）是AMF隨著宿主植物根系的生長分泌產生的一類含金屬離子（主要為鐵離子）的糖蛋白，主要存在于AMF菌絲體和孢子壁層結構中，隨著菌絲和孢子降解而進入土壤[5]。由于球囊霉素難溶于水，難于分解，在自然狀態下極為穩定[6-7]，且為土壤有機質的主要組成部分，是土壤有機碳的重要來源[8]，因此，球囊霉素被看作是土壤穩定性有機碳庫的一個重要組成部分。自1996年被Wright首次發現以來，球囊霉素被報道普遍存在于各種生態系統土壤中[7,9-10]，在改善土壤有機結構、土壤特性和促進土壤物質循環中發揮著重要作用[11]。目前球囊霉素的提取方法為非專性方法，用此類方法提取得到的球囊霉素并不完全來自AMF分泌，因此將其命名為球囊霉素相關土壤蛋白（Glomalin-related soil protein,GRSP）。根據GRSP提取的難易程度又將其分為總球囊霉素相關土壤蛋白（Total glomalin-related soil protein，T-GRSP）和易提取球囊霉素相關土壤蛋白（Easily extractable glomalin-related soil protein，EE-GRSP）。

茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]屬山茶科山茶屬茶樹種，為多年生常綠木本植物，是我國重要的經濟作物之一。人們早在20世紀初就發現茶樹根際存在AMF形成的菌根[12]。現有研究證實，AMF廣泛存在于我國茶園土壤中[13-18]，且茶樹對菌根依賴性（Mycorrhizal dependence，MD）比較高，屬于菌根依賴性較強的植物[19]。目前，茶樹AMF研究較少，亞洲茶樹種植國家中目前只有中國、印度和泰國等開展了有關茶樹菌根方面的研究[20-21]。有關茶樹根際土壤GRSP的研究更少，截止目前，還未見茶樹土壤GRSP相關的研究報道。土壤GRSP的含量和組成受氣候條件、植被類型、土壤特性、AMF組成等多種生態環境因子的影響，因此不同茶樹品種、不同種植地GRSP會有所不同。筆者于貴州省茶區采集不同品種、不同種植區域茶樹根際土壤樣品，研究土壤GRSP相關蛋白質的含量及其與土壤理化性質的關系，以期為了解和評價茶樹根際土壤質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集與處理

樣品采集于2013年7～9月，共計采集土壤樣本54個。選擇如下幾個貴州省重點的茶樹種植地：湄潭縣（MT）、石阡縣（SQ）、貴定縣（GD）和都勻市（DY），進行土壤樣品采集，采集地種植的茶樹品種分別為湄潭苔茶群體種（C.sinensis cv.MeitanTaicha,MTTC）、石阡苔茶群體種（C.sinensis cv.ShiqianTaicha,SQTC）、貴定鳥王群體種（C.sinensis cv.GuidingNiaowang,GDNW）和都勻毛尖群體種（C.sinensis cv.DunyunMaojian,DYMJ），同時在種植福鼎大白茶（C.sinensis cv.MeitanTaicha,FDDB）的4個種植區內都采集土樣。土樣采集采用五點取樣法。在距茶樹主干0～20 cm、無雜草處進行，輕輕去除表面枯枝落葉凋落物后，按照茶樹某一根系走向開挖。挖到有茶樹根系后，取茶樹根系周圍0～40 cm深、10～20 cm寬范圍內土層土壤。五點共計取約5 kg土壤，置于干凈布袋中，混合均勻，封好帶回實驗室，置于陰涼避光處攤開，撿出石子和異物，自然風干。將一部分風干的土樣過2 mm篩，用于土壤理化性質測定；另外一部分過1 mm篩，用于球囊霉素相關土壤蛋白的測定。

1.2 土壤理化性質測定

土壤基本理化性質采用魯如坤方法[22]測定。其中，pH采用電極電位法；水解氮（Hydrolysable nitrogen，Nh）采用堿解擴散法；速效磷（Available phosphorus，Pa）含量用碳酸氫鈉-鋁銻抗比色法；速效鉀（Available potassium，Ka）采用乙酸氨基-火焰光度法；土壤有機質（Organic matter，OM）采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法。

表1　取樣地區基本信息Table 1 Basic information of the soil sampling areas

1.3 球囊霉素相關土壤蛋白測定

球囊霉素相關土壤蛋白的提取實驗根據Wright and Upadhyaya[7]的方法，具體操作步驟如下：

EE-GRSP提?。壕_稱取1.00 g風干土，加入10 mL離心管（含有8 mL、20 mmol·L-1、pH 7.0的檸檬酸鈉溶液），充分混勻，121℃，0.1 MPa滅菌30 min，冷卻后4 750 r·min-1離心10 min，取棕紅色上清液待測。

T-GRSP提?。壕_稱取1.00 g風干土，加入10 mL離心管（含有8 mL、50 mmol·L-1、pH 8.0的檸檬酸鈉溶液），充分混勻，121℃，0.1 MPa滅菌60 min。冷卻后3 700 r·min-1離心20 min。吸取上清液，收集在無菌小燒杯中，離心管中加入等量檸檬酸鈉溶液反復提取4～5次直到上清液棕紅色消失為止。將所有提取的上清液混合，4 750 r·min-1離心10 min，待測。

測定：采用Bradford法測定[7]，以牛血清蛋白作為標準，繪制標準曲線，同時利用紫外分光光度計測定待測樣品在595 nm處吸光度，通過濃度-吸光度方程，得出T-GRSP和EE-GRSP的濃度，結合浸提液體積和浸提時所取土壤質量，計算出單位質量土壤中T-GRSP和EE-GRSP的含量。

1.4 數據處理

使用Excel進行數據初步整理分析，采用SPSS 17.0生物統計分析軟件對不同樣GRSP含量進行方差分析，并與土壤理化性質進行相關性分析、線性回歸分析。采用數據作圖工具origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 茶樹根際土壤因子分析

由表2可知，茶樹根際土壤因子在不同茶樹品種間、同一茶樹品種不同樣地間存在差異。茶樹土壤pH在3.99～6.15之間，均為酸性土壤，大部分土壤pH小于4.50，有酸化趨勢；部分取樣點pH小于4.00，存在土壤嚴重酸化現象；除SQTC和GDNW不存在統計差異外，不同茶樹品種間土壤pH值存在顯著差異（P<0.05），同一地區不同茶樹品種間，除湄潭縣外，其他均存在顯著差異（P <0.05）。

茶樹根際土壤營養水平在不同茶樹品種間、同一茶樹品種不同種植地間也表現出顯著差異（P<0.05），呈現出無規律性變化。土壤水解氮在78.50～454.06 mg·kg-1之間，速效磷在0.53～81.55 mg·kg-1之間，速效鉀在53.16～293.70 mg·kg-1之間，有機質在17.70～80.79 g·kg-1之間，均值分別為173.29、16.45、133.55 mg·kg-1和34.05 g·kg-1，除速效磷略低外，其他均高于優質高效高產茶園的土壤營養指標[23]；速效磷最高值與最低值差別比較大，達153.87倍，水解氮、速效鉀和有機質的則僅在4.56～5.85倍之間；土壤養分指標變化幅度較大，變異系數以速效磷最高，為113.69%，其他3個養分指標變異系數稍小，但均大于30%。

2.2 茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白含量分析

表2　茶樹根際土壤理化性質及球囊霉素相關土壤蛋白含量Table 2 Soil factors and glomalin-related soil protein in the rhizosphere of tea plant

由表2可知，茶樹根際GRSP含量較高，其中，T-GRSP在5.71～22.84 mg·g-1之間，EE-GRSP在2.35～7.91 mg·g-1之間，均值分別為12.96 mg·g-1和4.88 mg·g-1；T-GRSP和EE-GRSP變化幅度較為類似，變異系數分別為27.92%和26.51%。茶樹根際GRSP含量與茶樹品種有關（圖1），T-GRSP和EE-GRSP在不同茶樹品種間的變化規律大體一致：T-GRSP和EE-GRSP在不同茶樹品種間表現出差異均較大，GDNW根際T-GRSP和EE-GRSP含量最高，而DYMJ根際T-GRSP 和EE-GRSP最低；不同的是，T-GRSP在FDDB、MTTC和SQTC根際表現出顯著差異（P<0.05），而EE-GRSP在這3個品種根際無顯著差異（P<0.05）。

續表2

不同種植區域間，茶樹根際GRSP差異較大（圖2）。T-GRSP和EE-GRSP表現規律一致，為：GD＞MT＞SQ＞DY。在GD和MT兩個區域，EE-GRSP取樣檢測結果均最高，兩者無顯著性差異（P<0.05）；在DY區域內取樣檢測結果平均值均最低，顯著低于其他3個區域（P<0.05）。表明茶樹根際GRSP含量與種植區域有很大關系。

2.3 茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白與土壤因子的相關性分析

由表3可知，茶樹根際T-GRSP和EE-GRSP含量與土壤因子有顯著相關性，其中，T-GRSP與水解氮、速效鉀和有機質含量極顯著正相關（P<0.01）；EE-GRSP與水解氮、速效鉀和有機質含量極顯著正相關（P<0.01），與土壤pH值顯著負相關（P<0.05）。T-GRSP 和EE-GRSP間也存在極顯著正相關性（P<0.01）。

圖1　不同茶樹品種根際球囊霉素相關土壤蛋白含量Fig.1 The contents of glomalin-related soil protein in the rhizosphere of different tea cultivars

圖2　不同取樣地茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白含量Fig.2 The content of glomalin-related soil protein in the rhizosphere of tea plant in different samping areas

表3　茶樹根際T-GRSP和EE-GRSP與土壤因子的相關性分析Table 3 Relative analysis between T-GRSP,EE-GRSP and soil factor

2.4 茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白與土壤因子的多元線性分析

根據多元線性回歸基本原理，分別以T-GRSP和EE-GRSP為因變量，以土壤因子（pH值、水解氮、速效磷、速效鉀、有機質）為自變量，進行多元線性回歸分析，利用最小二乘法原理估計參數，同時利用stepwise法剔除不顯著因子和有相關關系的因子，從而最終確定對茶樹根際T-GRSP和EE-GRSP有明顯影響的土壤因子，得T-GRSP和EE-GRSP與土壤因子多元線性回歸方程為：Y1=7.723+ 33.878x2+21.109x3+0.047x5（F=63.601），Y2=3001.953+8.083x2+3.559x3（F=22.642）。式中，Y1為T-GRSP，Y2為EE-GRSP，x2為速效氮，x3為速效鉀，x5為有機質含量。經檢驗，各個方程檢驗值F的顯著性概率均小于0.05，說明回歸效果較好，回歸方程均有顯著意義；對各系數進行t檢驗，結果各顯著性水平都小于0.05，說明各因子對Y的影響都很顯著。根據多元線性回歸方程自變量系數可知，對于T-GRSP的貢獻，水解氮＞速效磷＞有機質；對于EE-GRSP的貢獻，水解氮＞速效磷。

3 討論

3.1 茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白的含量

GRSP是迄今為止發現的唯一一種AMF分泌到土壤中的蛋白質，普遍存在于土壤生態系統中，在農田、草原、落葉熱帶雨林、灌木林等生態系統中均測定到GRSP[7,9-10]。一般而言，土壤GRSP的含量為2～15 mg·g-1[24]，中大西洋地區為15 mg·g-1，而在夏威夷熱帶土壤中則高達100 mg·g-1，在干旱地區含量則相對偏低[25]。

本次試驗結果表明，茶樹根際T-GRSP和EE-GRSP平均含量分別為12.96 mg·g-1和4.88 mg·g-1，總體含量相對偏高，遠高于國內黃土高原狼牙刺和紫穗槐以及荒漠油篙和沙棘根際GRSP含量[26-29]?？赡茉蚴怯捎诓铇錇槿~用栽培植物，每年需施加大量基肥和追肥，因此增加了土壤營養水平，而上述其他4種植物為野生植物，且環境較為惡劣，土壤營養水平低。鄧萬剛等[24]報道同為栽培植物的橡膠樹根際GRSP含量在3.56 mg·g-1以下，也遠低于茶園GRSP含量，可能由于橡膠樹的施肥要少于茶樹的緣故。

需要特別指出的是，Bradford法測定GRSP存在一定缺陷。由于Bardfod法不能完全去除土壤中的非球囊霉素蛋白，因此無論是T-GRSP還是EE-GRSP均會因為其他蛋白的存在而偏高。單克隆抗體酶聯免疫（ELISA）方法能更精確測定GRSP含量，但是，該法容易受土壤有機質影響，只適用于土壤有機質含量低的土壤樣品[25,30-31]，且費用較大，鑒于茶樹根際土壤有機質含量相對較高，濃度范圍又較廣，本研究中仍采用Bradford法測定。

3.2 土壤pH對茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白的影響

GRSP是AMF分泌產生的糖蛋白，因此，凡是能影響AMF生長的因子均會影響GRSP含量的變化[32]?，F有研究表明，土壤中GRSP的含量和組成受氣候條件、植被類型、土壤特性、AMF組成等多種生態因子的影響[33]，以土壤因子（土壤pH和土壤營養因子）為最重要的影響因素。

土壤pH是影響AMF的一個重要生態因子，所以它對GRSP含量也有一定影響。本研究中，茶樹根際GRSP含量與土壤pH負相關，T-GRSP與土壤pH負相關性不顯著，但EE-GRSP與土壤則達到顯著負相關（P<0.05）?？赡苁怯捎谒{查的茶樹根際土壤pH在3.99～6.15間，pH過低，而一般說來，中性至微酸性土壤有利于AMF發育，pH過高或過低則不利于AMF發育[34]。土壤pH與T-GRSP負相關性，但不顯著，而與EE-GRSP呈顯著負相關性，可能是由于EE-GRSP是由AMF新近產生的[7]，因此茶樹土壤pH過低不利于AMF的發育，進而不利于AMF分泌EE-GRSP，表現出EE-GRSP含量較低；而T-GRSP中還含有AMF菌絲降解而進入土壤的GRSP，因此受AMF發育的影響較小，表現為受土壤pH影響不顯著。

3.3 土壤營養因子對茶樹根際球囊霉素相關土壤蛋白的影響

GRSP是土壤有機質的主要組成部分，是土壤有機碳、氮的重要來源[8]，其主要功能是增加土壤有機碳庫和改善土壤團聚體[7,34-35]，因此，GRSP被認為是AMF對宿主植物生長環境調整和適應的一種積極應答機制。

已有的研究表明，土壤中GRSP含量和有機碳、氮含量呈正相關[6-7,10]。本試驗中，GRSP含量與有機質、速效氮含量正相關。前人的研究以有機碳表示，而本文以有機質表示，有機質與有機碳之間為常數換算關系（Van Bemmelen=1.724），不影響相關性，因此，本研究結果與前人一致。有機質、速效氮影響GRSP的原因，可能是由于茶園施肥措施改善了土壤結構，增加土壤中AMF數量和侵染能力[34,37]，同樣也促進GRSP的產生。

磷為影響茶樹和AMF生長的重要元素，其主要由土壤提供。貴州茶區土壤普遍缺磷[38]。速效磷顯著影響叢枝菌根真菌對植物的侵染[39-40]，低磷水平下，植物通過AMF的根外菌絲間接吸收磷及其他營養元素從而提高植物的磷吸收效率；高磷水平下，速效磷的供應使AMF生長受阻，在土壤中的菌絲降解，產生大量的球囊霉素，積累于土壤中，從而使土壤速效磷與土壤球囊霉素之間呈明顯正相關。本試驗中，速效磷含量也較低，因此表現出與GRSP正相關；但相關性不顯著，可能是由于茶園施肥增加了土壤速效磷含量的緣故。

4 結論

AMF為農業生態系統有巨大潛在應用價值的微生物資源，一直是人們研究和開發的熱點。GRSP作為迄今為止發現的唯一一種AMF分泌到土壤中的蛋白質，為進一步揭示AMF在生態系統中的地位和功能開辟了一個新的領域。本研究發現，茶樹根際GRSP較為豐富，T-GRSP和EE-GRSP含量分別在5.71～22.84 mg·g-1之間和2.35～7.91 mg·g-1之間，均值分別為12.96 mg·g-1和4.88 mg·g-1。在不同茶樹品種、不同種植區域GRSP含量存在顯著差異，表明GRSP含量受茶樹品種和種植區域的影響。另外，相關性和線性回歸分析發現，GRSP含量與土壤因子顯著相關，其與Na、Ka和OM更達到極顯著水平。因此，GRSP能較好地反映茶樹根際土壤的質量狀況，可作為茶樹土壤質量評價的一項新指標。

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Contents of Glomalin-related Soil Protein and Its Correlations with Soil Factors in the Rhizosphere of Tea Plant[Camellia Sinensis(L.)O.Kuntze]

GAO Xiubing1,XING Dan2,CHEN Yao1,ZHOU Fuyu1,ZHAO Huafu1,CHEN Juan1,GUO Can1,ZHOU Yufeng1*

1.Tea Research Institute,Guizhou Academy of Agricultural Science,Guiyang 550006,China;
2.Institute of Pepper,Guizhou Academy of Agricultural Science,Guiyang 550006,China

Abstract:Glomalin-related soil protein(GRSP)is a kind of glycoprotein containing metal ions that are secreted by arbuscular mycorrhizal fungi(AMF).It plays an important role in maintaining physiological functions of AMF and stabilization of soil organic carbon and soil aggregate.In this paper,the contents of GRSP and its correlations withbook=192,ebook=85soil factors were analyzed in the rhizosphere of tea plant[Camellia Sinensis(L.)O.Kuntze].Total glomalin-related soil protein(T-GRSP)and easily extractable glomalin-related soil protein(EE-GRSP),as well as soil factors were investigated by Bradford and conventional soil factors analysis method in four key tea planting areas(Meitan county,Shiqian county,Guiding county and Douyun city)of Guizhou province,southwest China.The results showed that GRSP levels were dependent on both rhizospheres of different tea cultivars and planting areas.The range of T-GRSP and EE-GRSP were 5.71-22.84 mg·g(-1)and 2.35-7.91 mg·g(-1),with average of 12.96 mg·g(-1)and 4.88 mg·g(-1)respectively.Correlation analysis showed that T-GRSP was significant positive correlation with hydrolysable nitrogen(Nh),organic matter(OM)and available potassium(Pa).EE-GRSP was positive correlated with Nh,Paand OM,but negative correlated with soil pH.The result of multiple linear regression equation showed that different soil factors showed different impact on the content of T-GRSP and EE-GRSP.For T-GRSP:Nh> Pa> OM.For EE-GRSP:OM > Pa.These results showed the GRSP was remarkably abundant in the rhizosphere of tea plant and closely related with soil factors,so the content of GRSP may be an appropriate index for evaluating soil quality in tea garden.

Keywords:tea tree(Camellia Sinensis),arbuscular mycorrhiza fungi,glomalin-related soil protein,soil factors

作者簡介：高秀兵，男，碩士，助理研究員，主要從事茶樹叢枝菌根真菌多樣性方面研究。*通訊作者：gzzhouyf@sohu.com

基金項目：貴州省科學技術基金項目（[2013]2155）、貴州省農科院研究生基金項目（2011007）、貴州省農業科技攻關項目（[2012]3022、[2013]3002、[2011]3046）、貴州省農業動植物育種專項（[2015]003）。

收稿日期：2015-09-21

修訂日期：2015-12-22

中圖分類號：S571.1；S154.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）02-191-10