回藥失荅剌知丸抗大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的實驗研究

左艷麗　賈孟輝　于凌志　王佩佩　劉　麗　蘇　丹　李占濤

1．寧夏醫科大學中醫學院，寧夏　銀川　750004；2．寧夏醫科大學第二附屬醫院，寧夏　銀川　750001；

3．回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏　銀川　750004

?

回藥失荅剌知丸抗大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的實驗研究

左艷麗1賈孟輝2，3*于凌志1王佩佩2劉麗2蘇丹1李占濤1

1．寧夏醫科大學中醫學院，寧夏銀川750004；2．寧夏醫科大學第二附屬醫院，寧夏銀川750001；

3．回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏銀川750004

【摘要】目的：觀察回藥失荅剌知丸對大鼠腦缺血再灌注后腦組織中Fas及FasL表達的影響，探討失荅剌知丸治療腦缺血性疾病的機制。方法：SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、金納多組、失荅剌知丸低濃度組、失荅剌知丸中濃度組、失荅剌知丸高濃度組，局灶性腦缺血再灌注模型制備成功后分別于12h、24h、72h取材，采用干濕重法測腦含水量，免疫熒光法觀察Fas陽性細胞表達量，TUNEL和免疫組化法觀察神經細胞凋亡情況及FasL表達的變化。結果：與假手術組相比，缺血再灌注損傷后腦含水量、神經細胞凋亡數量及Fas、FasL的表達明顯增高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，用藥組各時段腦含水量、神經細胞凋亡數量及Fas、FasL的表達均減弱(P<0.05)，以失荅剌知丸高濃度組的表達減弱顯著(P<0.01)。結論：失荅剌知丸能夠有效減輕腦組織水腫，抑制Fas、FasL的表達，其發揮神經保護的作用機制可能與抑制神經細胞凋亡有關。

【關鍵詞】失荅剌知丸；腦缺血；Fas；FasL

隨著人口老齡化進程的加速，高血壓、冠心病等相關危險因素的增加，腦血管疾病的發病率也逐年攀升，對人類的生命健康和生活質量造成了嚴重的威脅。其中，缺血性腦血管疾病最為常見，約占腦血管疾病的80%左右[1]。目前，臨床上最常用的是在有限的時間內進行溶栓等治療以達到恢復腦血管血液供應的目的，但有可能造成腦組織的進一步損傷，即腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷機制龐雜，相互交聯，有研究表明，細胞凋亡在其發病進程中擔任著至關重要的角色。細胞凋亡多發生于腦缺血急性期，主要出現在缺血半暗帶區和對缺血缺氧敏感的海馬、齒狀回和大腦皮質[2]，神經細胞凋亡數量的多少決定著腦組織梗死體積的大小。細胞凋亡是一個有嚴格程序控制的可逆過程，因此，著力于調控其機制，限制其進一步發展，對減小腦梗死體積以及神經功能恢復等具有重大意義[3]。失荅剌知丸作為回醫藥治療腦缺血性疾病的傳統、經典方藥，前期系列研究業也表明：失荅剌知丸可以調節細胞抗凋亡信號轉導通路PI3K-AKT通路的活性，上調PI3K和AKT的表達，通過抑制促凋亡分子的活化，抑制神經細胞凋亡[4]。Fas/FasL 是目前研究較為清楚的死亡受體信號轉導通路，在正常大腦中維持免疫抑制狀態，當腦缺血發生后，Fas與FasL交聯，參與并促進腦缺血再灌注所引起的腦組織損傷[5]。為進一步探討失荅剌治丸保護缺血再灌注損傷腦組織的作用機制，筆者開展失荅剌治丸對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織FasL表達水平的實驗研究，現報告如下。

1材料

1.1動物SD大鼠，雄性，80只，SPF級，體重(280±50)g，購于寧夏醫科大學實驗動物中心，合格證編號：SCXK(寧)2011-0001，所有大鼠均在同一動物房內常規飼養3d后進行實驗。

1.2藥物失荅剌知丸(出自《回回藥方考釋》)：柴胡30g，黑訶子30g，蘆薈60g，元胡6g，石菖蒲6g，番鹽6g，藥西瓜9g，松蕈9g，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，蓽撥3g，白芥子3g，蕓香3g，巴豆9g，共計213g，以上所有藥物切制、煎煮后放置于恒溫水浴鍋中分別濃縮至低濃度1.112 g/ml、中濃度2.223g/ml、高濃度4.446g/ml的藥液，置于4 ℃冰箱備用。金納多(銀杏葉提取物，德國威瑪舒培公司)臨用前配制成1.04mg/ml的混懸液。

1.3試劑水合氯醛(批號：2636-4A，國藥集團化學試劑有限公司，臨用前配成濃度為10%的水合氯醛溶液)；兔抗大鼠Fas抗體(批號：BA0048)、兔抗大鼠FasL抗體(批號：BA0148)、山羊抗兔IgG(批號：BA1128)、濃縮型正常山羊血清(批號：AR1009)均為博士德生物公司產品。

1.4儀器FX4-2型電熱恒溫干燥箱(Shella公司)：BT224S 型電子天平(Sartorious公司)。

2方法

2.1分組及給藥80只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、金納多組、失荅剌知丸低濃度組、失荅剌知丸中濃度組、失荅剌知丸高濃度組，后5組采用線栓法制備大腦中動脈阻塞-再灌注模型，并分為術后12、24、72h三個亞組，共16組，每組5只。SD大鼠給藥量為1ml/100g，用藥組分別給予相應藥物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手術組、模型組給予相應濃度的生理鹽水。

2.2模型制備參照改良的Longa法[6]，利用線栓阻塞大鼠大腦中動脈，造成腦缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位，沿頸部正中線切開，依次鈍性分離左側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，將直徑為0.24mm的線栓自頸外動脈小切口處插入至頸內動脈，直至感到輕微阻力，長度約為18±2mm，用手術縫合線將頸外動脈小切口和線栓尾端一起結扎，阻斷血流2h后實行再灌注，待大鼠清醒后進行神經功能評分，評分≥2分者作為模型成功標準。假手術組鈍性剝離頸內外動脈后縫合傷口。

2.3取材各組分別于術后12h 、24h、72h取材，10%水合氯醛過量麻醉大鼠，經心尖生理鹽水沖洗，再換用4%多聚甲醛溶液進行灌注固定，取出全腦，切取缺血側大腦海馬區，常規石蠟包埋，余腦組織放于凍存管保存在液氮內。

2.4腦含水量測定采用干濕質量法測定缺血側含水量，于各時間點麻醉大鼠，快速斷頭取腦，將待測腦組織濾紙擦去表面水分，稱取濕質量后置于100℃電烤箱24h，稱取干質量。腦含水量 =(m濕質量-m干質量)/m濕質量×100%。

2.5腦組織病理學觀察待測腦組織切片后經HE染色，在光學顯微鏡下觀察腦組織結構的變化。

2.6TUNEL細胞凋亡檢測標本經常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，嚴格按TUNEL檢測試劑盒進行操作。以胞核內有棕黃色顆粒者為凋亡陽性細胞，在400倍鏡下隨機選取梗死灶周邊五個不重疊的視野拍照并計數凋亡陽性細胞數，取平均數進行統計。

2.7免疫熒光法檢測Fas表達待測腦組織經過常規包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復、復溫、山羊血清封閉、滴加兔抗大鼠抗體、滴加山羊抗兔熒光二抗、封片、熒光顯微鏡下觀察，假手術組對照使用PBS緩沖液代替一抗，余相同，所有步驟嚴格按照試劑盒說明操作。每個標本取 3 張切片，每張切片取3 個互不重疊部位，應用激光掃描共聚焦顯微鏡掃描(掃描參數：激發光波長488 nm，檢測的發射光波長518nm)，計數400×視野下熒光陽性細胞，取平均值。

2.8免疫組化法檢測FasL表達標本切片為6mm，經常規二甲苯和梯度酒精脫蠟水化，枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復，3% H2O2消除內源性過氧化物酶，滴加10%的山羊血清封閉1h，滴加一抗4℃冰箱過夜，陰性對照組加PBS緩沖液，次日取出37℃復溫1h，PBS緩沖液沖洗3遍×5min，滴加二抗室溫置放1h，DAB染色，PBS緩沖液沖洗3遍×5min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以胞質或胞核內有棕黃色顆粒者為陽性細胞，每張切片在400倍鏡下隨機選取梗死灶周邊5個不重疊的視野拍照，并計數陽性細胞數，取平均數進行統計。

3結果

3.1腦含水量測定與假手術組相比，各組各時間點腦含水量均明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，各用藥組各時間點腦含水量均明顯降低(P<0.01)；與金納多組比較，失荅剌知丸中濃度及高濃度組腦含水量有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)；同組別72h相比，失荅剌知丸高濃度組減少更加明顯(P<0.01)。見表 1。

表1　各組大鼠腦組織含水量水平±s，n=5)

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01;與金納多組比較，aP<0.05，bP<0.01；與SDLZW高濃度組比較，cP<0.01。3.2病理學觀察假手術組大鼠腦組織神經元形態正常，大小均勻，排列整齊，層次分明；模型組大鼠神經形元態明顯異常，大小不均，神經元皺縮，排列紊亂，層次不清，多數細胞核呈現三角形或錐形；失荅剌知丸低劑量神經元細胞較紊亂，多數皺縮變形，大小欠均勻；金納多組及失荅剌知丸中濃度組大多數神經元形態欠規則，有皺縮現象，層次欠清晰，且各時間點神經元形態區別不明顯；失荅剌知丸高濃度組大鼠大多數神經元形態正常，存有少量皺縮神經元，層次較清晰，且正常神經元比例隨著用藥時間的延長而增多，以失荅剌知丸組72h組較明顯。

3.3各組缺血側海馬區Fas表達比較Fas蛋白主要位于神經細胞膜上，在本實驗中標記為綠色，與假手術組相比，各組各時間點Fas表達均明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，各用藥組各時間點Fas蛋白表達明顯減少(P<0.01)；與金納多組比較，失荅剌知丸中劑量組各時間點FasL蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，失荅剌知丸高劑量組各時間點Fas蛋白表達有所減少(P<0.05)，尤以72h組減少明顯(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠缺血側海馬區Fas免疫熒光陽性細胞數±s，n=5)

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01;與金納多組比較，aP<0.05，bP<0.01。

3.4對大鼠腦缺血再灌注TUNEL凋亡陽性細胞的影響從表3看出，與假手術組比較，模型組及各用藥組各時間點凋亡細胞數有顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組各時間點凋亡細胞數有減少(P<0.05或P<0.01)，以24h、72h凋亡細胞數減少尤為明顯(P<0.01)；失荅剌知丸組24h、72h組凋亡細胞數明顯少于金納多組(P<0.01)。見表3。

表3　各組TUNEL凋亡陽性細胞計數比較

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01;##P<0.01。

3.5對腦缺血再灌注大鼠缺血側海馬區FasL表達的影響從表4可以看出，與假手術組比較，模型組及各用藥組各時間點FasL蛋白表達明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，各用藥組各時間點FasL蛋白表達明顯減少(P<0.01)；與金納多組比較，失荅剌知丸中劑量組各時間點FasL蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)，失荅剌知丸高劑量組各時間點FasL蛋白表達有所減少(P<0.05或P<0.01)，尤以72h組減少明顯(P<0.01)。見表4。

表4　各組缺血側海馬區FasL蛋白表達的比較±s，n=5)

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01;與金納多組比較，aP<0.05，bP<0.01。

4討論

近年來，國內外研究發現腦缺血再灌注損傷主要與興奮性氨基酸、自由基損傷、血腦屏障破壞、炎癥反應、細胞凋亡等機制有關[7-8]。這些機制彼此重疊，互為因果，相互聯系，產生一系列快速級聯反應，最終導致腦組織的損傷[9]。在這個復雜的過程中，神經細胞的凋亡被認為是腦缺血再灌注損傷的主要環節，因此調控神經細胞凋亡成為治療缺血性腦病的關鍵所在。FasL在細胞凋亡中起著關鍵的作用。Fas被稱為死亡受體分子，屬于腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)/神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)受體家族，是促細胞凋亡的最重要分子之一。FasL作為Fas的天然配體與3個Fas 分子結合，促使死亡結 構域(DD)聚集后結Fas 的相關死亡結構域(FADD)，進而通過引起Caspase 酶聯反應致使細胞凋亡[10]。抑制因促凋亡系統Fas/FasL的激活而產生的生物學作用是發揮保護腦組織的關鍵環節[11]。已有大量研究發現中醫藥可以減輕腦缺血再灌注損傷后促凋亡因子的表達[12-13]。

失荅剌知丸出自《回回藥方》，是防治腦血管疾病的經典方劑，由柴胡、黑訶子、蘆薈、元胡、石菖蒲、藥西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、蓽撥、白芥子、蕓香等藥組成，以芳香通竅，利痰化濕，祛寒通絡為治療原則，運用大量芳香藥以加強血管通透性、增強藥物透過血腦屏障[14]，治療腦卒中后骨節疼痛，口眼歪斜，半身不遂等癥狀。研究結果顯示，腦缺血再灌注損傷發生后，對缺血缺氧敏感的海馬區腦含水量及神經細胞凋亡的數量迅速增加，于24h達到高峰，72h后下降。較模型組比較，各用藥組腦含水量及神經細胞凋亡的數量均有所減少，但不同濃度的失荅剌知丸下調水平有所差別，以失荅剌知丸高劑量組效果明顯，說明長期服用高濃度的失荅剌知丸可以通過抗凋亡以達到有效治療和緩解腦缺血再灌注損傷后引起的腦組織損傷。Fas、FasL在腦組織缺血后，迅速表達促進了神經細胞凋亡，擴大了梗死體積，實驗研究結果表明，不同濃度的失荅剌知丸較模型組相比，能夠明顯下調海馬區Fas、FasL蛋白表達，較金納多組相比，高劑量失荅剌知丸阻抑Fas、FasL蛋白表達作用更強。由此可見，失荅剌知丸可以通過降低Fas、FasL蛋白表達以減少神經細胞的凋亡，為臨床回醫藥防治缺血性腦血管疾病提供了實驗依據。

參考文獻

[1]2010 中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南[J].中國醫學前沿雜志，2010(4)：55-56．

[2]Neweomb J K，Zhao X，Pike B R，et al. TemPoral Profileof apoptosis-like changes In neuronsand astrocytes following controlled cortical impact injury in the rat[J]. JExP Neurol，1999，58(1):76-88.

[3]Cheng XL，Tang HF，Wang SC. Effect of Leermai capsules on pallium neural apoptosis following late stage cerebral ischemia reperfusion injury in rats [J]. China Pharm，2008，19 (27):2089-2092.

[4]王佩佩，賀曉慧，劉耀龍，等.失荅剌知丸對腦缺血大鼠再灌注后神經功能缺損及腦組織PI3-K和AKT表達的影響[J].寧夏醫科大學學報，2014，36(5)：473-477.

[5]趙紅，張國鋒，張華，等. 氟伐他汀對大鼠腦缺血再灌注損傷后Fas和FasL表達的研究[J].神經解剖學雜志，2015，31(1)：49-53.

[6]Zea Longable E，Weinsten PR，Carlson S，et al. Reversible middle

cerebral artery occlusion without Cranieetomy in rats[J]. Stroke，1989，20(1)：84-91.

[7]Appelboom G，Strozyk D，Meyers PM，et al. Current recommendations for endovascular interventions in the treatment of ischemic stroke[J]. Curr Atheroscler Rep，2010(12):244-250.

[8]Li M，Zhang XJ，Cui LL，et al. .The neuroprotection of oxymatrine in cerebral ischemia/reperfusion is related to nuclear factor erythroid 2-related factor 2(nrf2)-mediated antioxidant response: role of nrf2 and hemeoxygenase-1 expression[J].Biol Pharm Bull，2011，34(3):595-601.

[9]Du C，Hu R，Csernansky CA，et al. Very delayed infarction after mild focal cerebral ischemia:a role for apoptosis[J]. Cereb Blood Flow Metab，1996，16(2):195.

[10]劉艷明，張林明，馬靜萍.辛伐他汀預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護 作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2010，8(2):203-204.

[11]胡躍強，胡國恒，龍華君，等.清熱化瘀方提取物預處理對大鼠腦缺血耐受作用及T2KIT2K表達的影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2008，10(8):153.

[12]陳萌，趙淑敏，李涵，等.黃芩莖葉總黃酮預處理對腦缺血再灌注大鼠海馬Fas、FasL的表達和抗氧化能力的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19(4):228-232.

[13]高欣，康立源，高秀梅. 腦缺血后神經細胞凋亡通路及中藥干預[J]. 中國中醫藥信息雜志，2007，14(7):96-98.

[14]賈孟輝，王曉麗，王佩佩，等. 失荅剌知丸對中風恢復期患者血清TNF-α和IL-6水平干預作用的研究[J].中醫藥臨床雜志，2014，26(5):465-468.

The Relationship between Different Concentrations of Shida Lazhi Wan and Cell Apoptosis after Ischemia Reperfusion Rats

ZUO Yanli1JIA Menghui2，3*YU Lingzhi1WANG Peipei1LIU Li1SU Dan1LI Zhantao1

1.Traditional Chinese Medicine School of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004,China；2.The First People’s Hospital Yinchuan 750001,Chian；3. Key laboratory of authorized by China's ministry of education on Hui Medicine，Yinchuan 750004,China

Abstract:Objective: To observe the effect of expression of Fas and FasL in the hippocampus of ischemia-reperfusion injury rats brain tissue by taking Shida Lazhi Wan, and to explore Shida Lazhi Wan mechanism for the treatment of cerebral ischemic diseases. Methods: SD male rats were randomly divided into 6 groups: sham group，the ischemia reperfusion model group (hereinafter referred to as the model group)，JinNaDuo group，Shida Lazhi Wan low concentration group， Shidalazhiwan medium concentration group，Shida Lazhi Wan high concentration group, After focal cerebral ischemia models were established，at 12h、24h、72h，neurons apoptosis，wet and dry weight measured brain water content， immunofluo-rescence techniques to measure Fas expression，TUNEL and immunohistochemical method to observe neuronal apoptosis and the change of FasL expression. Result: To compared with the sham operation group，after ischemia-reperfusion injury , brain water、number of nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were significantly increased(P<0.01, P<0.05)；compared with the model group， every treatment groups brain water number、nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were recede (P<0.05)，especially Shida Lazhi Wan high concentration group Reduce significantly (P<0.01). Conclusion：Shida Lazhi Wan can ?reduce brain water effectively, inhibition of Fas and FasL express, its nerve protection mechanism may be related to inhibition of neural cell apoptosis.

Key words:Shida Lazhi Wan；ischemia reperfusion；Fas；FasL

(收稿日期：2015.12.22)

【中圖分類號】R743

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)05-0073-04

作者簡介：左艷麗(1990-)，女，在讀碩士研究生。主要從事中醫藥、回醫藥防治心腦血管疾病的理論和臨床研究。E-mail:524023671@qq.com通信作者：賈孟輝(1962-)，男，主任醫師，研究生導師。主要從事回醫藥、中醫藥防治心腦血管疾病的理論及臨床研究。E-mail:JJJ94330@163.com

基金項目：國家自然科學基金(81260568)；銀川市科技攻關課題(2012017)。