板藍根多糖在C57小鼠抗結核感染中的作用*

向 田，劉 杲，楊 瑾

1 恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000；2 湖北民族學院中醫學院

板藍根多糖在C57小鼠抗結核感染中的作用*

向 田1，劉 杲1，楊 瑾2

1 恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000；2 湖北民族學院中醫學院

目的：探討板藍根多糖對結核感染小鼠的作用及其機制。方法：提取板藍根多糖配制成懸液后尾靜脈注射感染毒性結核分岐桿菌H37Rv C57小鼠，按照50 mg/kg的量對板藍根多糖治療組小鼠腹腔注射板藍根多糖溶液，連續注射1周，對照組注射等量的生理鹽水。觀察比較各組小鼠的生存率，脾臟、肺臟的病理變化及抗酸染色分析菌落數，用酶聯免疫吸附法測定小鼠脾臟細胞釋放的細胞因子，流式細胞術檢測脾臟CD4、CD8陽性T細胞比例。結果：經板藍根多糖治療的結核感染小鼠，生存率較對照組明顯提高，脾臟及肺臟的病理變化減輕，肺臟菌落數較對照組明顯降低，脾臟細胞分泌的細胞因子IFN-γ水平提高，白細胞介素-4(IL-4)變化無統計學意義，CD8 T細胞比例升高。結論：板藍根多糖能夠通過刺激Th1型細胞因子的產生進而增強C57小鼠的細胞免疫應答來抗結核分岐桿菌的感染。

結核分岐桿菌；Th1型細胞因子；細胞免疫；板藍根多糖

目前，結核病仍然是威脅人類生命健康的重要傳染病之一，全球每年因結核病死亡約200萬人，每年有約800萬結核病新發病例［1］。近年來，隨著免疫缺陷病毒(HIV)的流行傳播以及結核分岐桿菌耐藥株的不斷出現，導致全球結核病疫情更加嚴峻，被稱為21世紀的癌癥［2-3］。我國肺結核患者中耐藥率達8.32%［4］，給結核病的治療帶來了更為嚴峻的挑戰，因此急需開發新的抗結核病的治療藥物。

板藍根為十字花科植物菘籃和草大青的根，含有谷氨酸、精氨酸等多種氨基酸以及豐富的多糖成分(板藍根多糖)［5］。相關研究［6-9］表明，板藍根具有較好的抗菌、抗病毒作用，對大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、流感病毒以及非典型肺炎病毒(SARS病毒)等有較好的抑制作用；同時有研究［10-11］進一步證實板藍根多糖可顯著提高小鼠免疫功能，對氫化可的松所致免疫功能抑制小鼠脾指數、白細胞總數和淋巴細胞數的降低有明顯對抗作用；此外，板藍根多糖還能明顯增強抗體形成細胞功能［12］。

基于此，本研究將提取的板藍根多糖應用于毒性結核分岐桿菌H37Rv感染的C57小鼠模型，以觀察板藍根多糖對抗結核感染的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雌性C57小鼠，體質量18～20 g，購自武漢大學ABSL-3實驗動物中心，實驗動物合格證號：42000600013383，在該動物中心SPF級環境中飼養并完成所有實驗。

1.2 藥物及試劑板藍根顆粒(湖北民族學院醫學院楊瑾老師惠贈)；毒性結核分岐桿菌H37Rv(武漢市醫療救治中心提供)；小鼠IFN-γ、IL-4的ELISA試劑盒(購自eBioscience公司)；7H9結核培養基(購自BD公司)；小鼠FITC標記的CD4抗體、PE標記的CD8抗體(均購自eBioscience公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 結核感染小鼠及分組 取7H9結核培養基中的結核分岐桿菌H37Rv并計數，將濃度調整為5×107CFU/mL，每只小鼠取100 μL進行尾靜脈感染。感染后第5天將C57小鼠分為板藍根多糖治療組及磷酸鹽緩沖溶液(Phosphote buffer，Saline，PBS)對照組，每組12只，并設正常組12只。同時按照50 mg/kg的量對板藍根多糖治療組小鼠腹腔注射板藍根多糖溶液，連續注射1周，對照組注射等量的PBS。從治療開始后每天觀察小鼠的生存情況，連續觀察30天并做記錄。

1.3.2 脾臟、肺臟HE染色 30天后將小鼠頸椎脫臼處死后解剖分離脾臟和肺臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行常規HE染色，顯微鏡下觀察。

1.3.3 菌落計數 無菌條件下取2組小鼠肺組織，然后按每1 g質量的肺組織加1 mL生理鹽水，研磨成勻漿；以此原液作10倍梯度稀釋；選取3個稀釋度的懸液100 μL，分別涂布于改良羅氏培養基上，于37℃培養箱中培養16天后進行菌落計數。

1.3.4 ELISA法分別檢測小鼠脾細胞IFN-γ以及IL-4 無菌條件下取小鼠脾臟，然后按每1 g組織加1 mL含有10%胎牛血清的1640培養基，無菌研磨并過濾成單細胞懸液；將脾細胞接種于6孔細胞培養板中培養48小時后，收集培養上清，按照ELISA試劑盒說明檢測上清中IFN-γ以及IL-4的表達。

1.3.5 小鼠脾臟CD4、CD8T細胞比例檢測 將小鼠眼球放血，將血收集于含25 U/mL肝素的EP管中，然后同時加入5 μL的FITC標記的抗鼠CD4以及PE標記的抗鼠CD8抗體，避光室溫孵育30分鐘，破除紅細胞后上流式細胞儀進行檢測。1.4 統計學方法使用GraphPad Prism軟件分析數據，計量資料以(±s)表示，采用配對t檢驗，秩和檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 C57小鼠生存率在毒性結核分岐桿菌H37Rv感染后第8天，PBS對照組小鼠開始死亡，到第20天，已經死亡一半，第30天僅2只存活；而板藍根多糖治療組小鼠在第14天開始死亡，第30天有7只存活(P=0.0209)，見圖1。

2.2 小鼠脾臟、肺臟HE染色變化情況將小鼠脾、肺分別做HE染色后發現(放大倍數為100倍)，經板藍根多糖多次治療的結核感染小鼠脾臟淋巴多而集中，肺臟結構基本完整；而PBS對照組與正常組小鼠脾臟比較，淋巴分散甚至消失，肺泡融合及實變嚴重，見圖2。

圖2 小鼠脾臟、肺臟HE染色情況

2.3 小鼠肺臟菌落計數菌落計數(每mg log 10 CFU/mL)結果顯示板藍根多糖治療組為(5.52± 0.1778)CFU/mL，明顯少于 PBS對照組(8.96± 0.1005)CFU/mL(P=0.0022)，見圖3。

圖3 小鼠肺臟菌落計數

2.4 小鼠脾細胞IFN-γ以及IL-4變化情況 無菌制備小鼠脾細胞，收獲培養上清后測定IFN-γ以及IL-4的表達，發現板藍根多糖治療組小鼠脾細胞培養上清中IFN-γ表達增加(P＜0.0001)，而IL-4無明顯變化(P=0.1320)，見圖4。

2.5 小鼠脾細胞中CD4+T細胞及CD8+T細胞比例經板藍根多糖治療的結核感染小鼠脾臟CD8+T淋巴細胞增多，與PBS對照組相比差異具有統計學意義(P=0.005)，見圖5。

圖4 小鼠脾細胞IFN-γ以及IL-4變化

圖5 小鼠脾細胞中CD4+T細胞及CD8+T細胞比例

3 討論

板藍根是常用的清熱解毒類中藥，多糖是其發揮各種治療作用的重要成分之一［13］。臨床上常用來預防或治療流行性感冒病毒、乙肝病毒、乙型腦炎病毒等病毒感染［14-15］。同時，現代研究發現，板藍根具有一定的抗腫瘤作用，如梁永紅等［16］發現板藍根可以抑制肝癌BEL-7402細胞及卵巢癌細胞A2780的增殖等；大量研究證實，板藍根是一種具有廣譜抗菌作用的藥物，包括抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌等。鄭劍玲等［17］證實板藍根各級提取物包括乙醇提取液、正丁醇萃取液等對金黃色葡萄球菌具有很好的抑制作用。

另外，板藍根在抗菌的同時能夠增強動物機體的免疫功能。實驗證明板藍根多糖對特異性、非特異性免疫細胞免疫均有促進作用，腹腔注射板藍根多糖(50 mg/kg)可顯著增強小鼠的免疫功能。夏新中等［18］將板藍根多糖多次腹腔注射感染毒性鼠傷寒桿菌的小鼠后發現，板藍根多糖可以通過增強小鼠的體液免疫、細胞免疫進而顯著延長小鼠的生存率。張紅英等［19］以板藍根多糖作為免疫增強劑聯合豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗免疫仔豬，證明板藍根多糖能顯著提高仔豬外周血中CD8+淋巴細胞的百分數，增強豬對常規滅活病毒疫苗的免疫應答能力。

本研究首次將板藍根多糖應用于小鼠的結核感染模型中，實驗結果證實，以50 mg/kg的量腹腔注射結核感染的小鼠后，與生理鹽水對照組相比，板藍根多糖治療組可以顯著延長結核感染小鼠的生存率；小鼠脾、肺分別做HE染色后發現，經板藍根多糖多次治療的結核感染小鼠脾臟淋巴多而集中，肺臟結構基本完整；而生理鹽水對照組與正常小鼠脾臟比較，病理變化較重，淋巴分散甚至消失，肺泡融合及實變嚴重；小鼠肺臟菌落計數顯示，板藍根多糖治療組小鼠肺臟菌落數明顯少于生理鹽水對照組；進一步免疫學檢查發現，板藍根多糖可以促進結核感染小鼠脾臟細胞Th1型細胞因子IFN-γ的分泌，對Th2型細胞因子IL-4的分泌幾乎沒有影響；同時，板藍根多糖還可增加小鼠脾臟CD8+T的比例。以上研究結果初步證明，板藍根多糖可能通過活化CD8+T細胞以及促進Th1型細胞因子的產生發揮抗結核感染作用，其抗結核的具體機制還需進一步探討。

［1］ Dye C，Scheele S，Dolin P，et al.Consensus statement. Global burden of tuberculosis：estimated incidence， prevalence，and mortality by country.WHO Global Surveillance and Monitoring Project［J］.JAMA，1999，282(7)：677-686.

［2］ Anon.China takes action against tuberculosis and HIV co-infection［J］.Lancet，2010，376：488.

［3］ Migliori GB，Sotgiu G，Lange C，et al.Extensively drugresistant tuberculosis：back to the future［J］.Eur Respir J，2010，36(3)：475-477.

［4］ 成詩明.我國結核病研究概況［J］.中國防癆雜志，2011，33(9)：525-526.

［5］ 王蓓.板藍根的基礎研究及臨床應用［J］.廣西民族大學學報：自然科學版，2006，12：119-130.

［6］ 胡淑平，丁濤，張殿文，等.復方板藍根含片的抗菌作用及對免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2007，23(5)：188-190.

［7］ 孔維軍，趙艷玲，山麗梅，等.微量熱法研究板藍根中四種有機酸對微生物生長代謝的影響［J］.生物工程學報，2008，24(4)：646-650.

［8］ 王瑞軍.幾種中草藥對金黃色葡萄球菌體外抑制作用的研究［J］.現代食品科技，2009，25(9)：1104-1106.

［9］ 胡興昌，鄭偉強.板藍根粗提液抑制流感病毒的實驗研究［J］.上海師范大學學報，2003，32(1)：62-65.

［10］李苑，陳亦，胡興昌.板藍根枸杞提取液對小鼠免疫機能影響的比較［J］.上海師范大學學報：自然科學版，2006，35(5)：83-86.

［11］儲岳峰，李祥瑞，胡元亮.9種中藥成分對小鼠免疫細胞活性的影響［J］.南京農業大學學報，2004，27(1)：97-100.

［12］王曉丹，李慧慶.板藍根藥理作用研究進展［J］.黑龍江醫藥，2010，23(2)：241-243.

［13］李成義，楊苗苗，張櫻山，等.甘肅不同產地板藍根中多糖含量分析［J］.西部中醫藥，2015，28(2)：5-7.

［14］趙麗.板藍根藥理作用、臨床應用及不良反應［J］.河北中醫，2010，32(7)：1059-1060.

［15］彭愛紅.板藍根藥理活性成分及臨床應用進展［J］.中國當代醫藥，2010，17(12)：13-14.

［16］梁永紅，侯華新.板藍根二酮B體外抗癌活性研究［J］.中草藥，2000，31(7)：531-533.

［17］鄭劍玲，王美惠，楊秀珍.大青葉和板藍根提取物的抑菌作用研究［J］.中國微生態學雜志，2003，15(1)：18-19.

［18］夏新中，肖靜，石國芳，等.板藍根多糖對宿主抵抗鼠傷寒沙門菌感染能力的影響［J］.武漢大學學報：醫學版，2007，28(3)：348-350.

［19］張紅英，趙現敏，崔保安，等.板藍根多糖對豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫豬T細胞亞群的影響［J］.中國免疫學雜志，2007，23(2)：134-137.

Effect of Isatis Root Polysaccharide in C57 Mice with Anti Tuberculosis Infection

XIANG Tian1,LIU Gao1,YANG Jin2
1 The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China; 2 College of Traditional Chinese Medicine,Hubei Institute for Nationalities

A

1004-6852(2016)11-0007-04

2015-12-22

2011年湖北省自然科學基金計劃項目 (編號2011CDC018)。

向田(1981—)，女，在讀博士研究生，主管技師。研究方向：分子及感染免疫。