VEGF在脊髓型頸椎病動物模型椎間盤組織中的表達及意義*

樊成虎，唐曉棟，肖正軍，蘭曉飛

1 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅中醫藥大學

VEGF在脊髓型頸椎病動物模型椎間盤組織中的表達及意義*

樊成虎1，唐曉棟1，肖正軍2，蘭曉飛2

1 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅中醫藥大學

目的：探討血管內皮生長因子(VEGF)在脊髓型頸椎病動物模型椎間盤組織中的表達及意義。方法：將脊髓型頸椎病大鼠模型中取得的椎間盤組織（造模組）進行HE染色及VEGF免疫組化檢測，并與正常組作對照分析。結果：造模組大鼠頸椎間盤中髓核和纖維環VEGF的含量為74.10%和5.72%，分別高于對照組大鼠的28.40%和4.70%，2組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結論：脊髓型頸椎病病變椎間盤內可誘導產生VEGF，提示VEGF可能通過促進新生血管的發生、發展，在退變的椎間盤組織中發揮作用。

脊髓型頸椎病；組織學；免疫組織化學；血管內皮生長因子

頸椎病是一種臨床常見病，一般分型為局部型、神經根型、椎動脈型、脊髓型、交感型、混合型、食管壓迫型等。其中脊髓型頸椎病(Cervical Spondylotic Myelopathy，CSM)約占頸椎病分型的10～15%。其早期多以隱匿侵襲形式發展，容易漏診、誤診，后期致殘率高［1］。一般認為形成脊髓型頸椎病的主要原因是頸脊髓、附屬結構、血管受到來源于頸椎間盤退變、后凸、黃韌帶增生肥厚、鈣化，椎體骨贅增生等壓迫或刺激所致。

正常椎間盤是一個無血管的組織，營養供應主要是通過兩個途徑被動擴散，一是終板途徑，即椎體內血管的營養物質通過骨髓腔血竇-軟骨終板界面擴散到椎間盤，營養髓核與纖維環內層，是椎間盤主要的營養途徑；二是纖維環途徑，即纖維環表面血管營養纖維環外層口［2］。突出的椎間盤進入硬膜外腔后其碎片主要特征是邊緣區域有血管形成和巨噬細胞浸潤。髓核穿破后縱韌帶進入硬膜外腔后成為機體抗原，誘導以血管反應為中心的免疫性炎癥，硬膜外腔小血管爬行長入，單核、巨噬細胞系統通過新生毛細血管網侵入到突出的椎間盤組織內，它們釋放各種蛋白水解酶，分解髓核組織［3］。在椎間盤退變中可見新生血管生成的表現。有研究［4］發現血管形成、生長與許多細胞因子相關，血管內皮生長因子(VEGF)是其中一種重要的血管生長刺激因子［5］。陳飛等［6］研究表明退變椎間盤組織中有VEGF的表達，且VEGF的表達與退變程度呈正比。本研究通過動物造模法復制脊髓型頸椎病模型，并采用免疫組化技術檢測并探討VEGF在其中的表達和意義。

1 材料與方法

1.1 材料本實驗采用植骨法復制大鼠脊髓型頸椎病(CSM)模型。選用健康雄性SPF級6月齡Wistar大鼠60只，實驗動物許可證號：SCXK(甘) 2011-0001，體質量(250±20)g，經適應性喂養后，以隨機數字表法抽取20只為正常對照組，其余40只為CSM造模組。從造模組中選取造模成功的20只大鼠稱重，按體質量編號，并依照隨機數字表法分組。

1.2 方法1)采用HE染色進行形態學觀察；2)免疫組織化學法(SABC法)檢驗HIF-lα、VEGF的表達情況。3)免疫反應切片在BX60F／PM30-3型顯微照相系統下觀察并攝像。4)圖片應用彩色病理圖文分析系統進行免疫反應產物顯微圖像分析，得出平均光密度值和積分平均光密度值。

1.3 觀察指標1)HE染色觀察其中有無血管組織浸潤，椎間盤組織中軟骨細胞是否增生，纖維板狀結構有無破壞，基質是否增生，以確定是否有退變。2)VEGF免疫組化染色中胞漿或胞膜中出現紅色顆粒判斷為VEGF陽性細胞。如果陽性細胞總數＞5%判斷為陽性。

1.4 統計學方法數據采用SPSS 10.0統計軟件分析，采用方差分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

1)對照組椎間盤組織基質少見，軟骨細胞呈紡鍾形，無血管組織浸潤；而造模組椎間盤組織表現為軟骨細胞增生，纖維細胞基質合成增多，纖維環板層狀結構破壞，見圖1—2。2)VEGF的表達：在造模組和對照組中均可見VEDF的陽性表達。造模組大鼠頸椎間盤中髓核VEGF的含量為74.10%，高于對照組大鼠的28.40%，造模組大鼠頸椎間盤中纖維環VEGF的含量為5.72%，高于對照組4.70%，2組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 造模組椎間盤組織呈現退變、炎性樣改變(100×)

圖2 免疫組化染色中胞漿中VEGF陽性細胞(100×)

3 討論

人VEGF蛋白由美國科學家于1989年成功純化與鑒定。VEGF早期亦稱作血管通透因子(VPF)，是由2條相對分子質量各為24 000的單鏈，以二硫鍵組成的高度保守的同源二聚體糖蛋白。VEGF mRNA剪切方式不同，故可產生VEGFl21、VEGFl45、VEGFl48、VEGFl65、VEGFl83、VEGFl89和VEG206等7種蛋白形式［7］。作為一類多功能細胞因子，VEGF通過與受體特異性結合發揮作用。其生物學活性可表現為以下幾點。1)促血管發生、生成和成熟VEGF是血管形成的中心調控者，在生理及病理性血管生成中起著至關重要的作用。Mattar等［8］發現，在重組人骨形態發生蛋白(rhBⅧ)-2基礎上加入VEGF后血管生成數量(毛細血管密度)明顯高于未加入組(單純rhBMP-2)，說明VEGF促血管生成和發生的作用是明確的。2)對細胞外基質的作用EGF可改變細胞外基質(ECM)，使其利于細胞生長；同時在ECM的基礎上，VEGF可發揮更強的促血管生成和發育的作用。3)增加血管通透性，Murata等［9］在研究大鼠糖尿病視網膜病變模型時發現模型中VEGF的免疫反應性明顯增高，血管周圍尤其明顯，并在血管周圍檢測到外滲的白蛋白，說明VEGF可增加血管通透性。4)維持血管功能。VEGF通過刺激內皮細胞生長促進一氧化氮分泌，起到維持血管功能的作用。5)參與調節促進骨生成，VEGF在脊髓型頸椎病退變的椎間盤內表達呈陽性。Liu XW等［10］對觀察組78只SD大鼠構建椎間盤退變模型，3個月后與對照組(8只正常SD大鼠)比較VEGF陽性表達率，結果觀察組VEGF陽性率分別為74.4%，其中毛細血管滲透率達62.8%，均較對照組高且差異有統計學意義(P＜0.05)。孫小航等［11］觀察不同月齡新西蘭大白兔椎間盤組織中VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達的變化情況，發現隨著月齡的增加，椎間盤中各組織結構成分發生從生長、成熟到退變的相應變化。VEGF和bFGF的表達都經歷了從有到無、再從無到有的變化，他們的表達強度也都隨著月齡從強到弱、再從弱到強；并且VEGF和bFGF的表達和椎間盤組織結構的變化具有相似性。VEGF在不同時期和狀態時在椎間盤中的表達提示它在椎間盤發育、成熟和退變過程中可能具有重要的調節作用。龍厚清等［12］發現胎兒椎間盤脊索細胞和纖維環外層血管內皮細胞出現陽性免疫染色，陽性率達87.5%，生長期和成人期椎間盤未見陽性表達；退變突出組總陽性率為83.3%，VEGF表達主要出現于破裂型和游離型椎間盤突出(P＜0.01)，提示胎兒期和破裂型(包括游離型)突出椎間盤組織可產生內源性VEGF，且對VEGF進行了定量，充分說明突出椎間盤中VEGF的陽性表達與病程、突出類型密切相關。

綜上所述，VEGF在椎間盤中的高表達，標志著椎間盤退變的開始，并可誘導和加速椎間盤的退變。且在此過程中，VEGF均與血管浸潤及椎間盤退變程度呈正相關。因此有觀點認為，椎間盤的微環境中細胞因子的相互作用，表現為一個復雜的、立體的、多元的關系結構，而VEGF可能是其中關鍵作用點之一。退變頸椎間盤組織中VEGF的表達與突出類型相關，VEGF可能在抑制椎間盤的退變中發揮重要作用。HIF-lα和VEGF共同參與了椎間盤退變；HIF-lα可能通過上調VEGF的表達來促進椎間盤組織中新生血管的形成，進而延緩椎間盤退變的發生。但二者的協同機制需進一步完善研究。通過調節二者的活性防治椎間盤退變，對治療脊髓型頸椎病提供了新的思路。

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Expression and Meaning of VEGF in Intervertebral Disc Tissue of Animal Model with Cervical Spondylotic Myelopathy

FAN Chenghu1,TANG Xiaodong1,XIAO Zhengjun2,LAN Xiaofei2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

B

1004-6852(2016)11-0132-03

2016-01-17

蘭州市科技局項目(編號2011-2-35)。

樊成虎(1963—)，男，碩士研究生導師，教授，主任醫師。研究方向：脊柱脊髓相關疾病的診治。