新型全反式維甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對肝癌細胞株 HepG2增殖的影響

劉 慧，周 青，汪 淵

新型全反式維甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對肝癌細胞株 HepG2增殖的影響

劉 慧，周 青，汪 淵

目的研究 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 （ATPR）對人肝癌細胞株 HepG2增殖的影響，并初步探討其可能的作用機制。方法選取 HepG2細胞為研究對象，全反式維甲酸（ATRA）和 ATPR分別作用細胞，應用 MTT比色法測定細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期分布情況，Western blot法檢測 HepG2細胞內周期蛋白 D（cyclinD）及細胞周期蛋白依賴性激酶 4（CDK4）和 CDK6蛋白表達量。結果ATPR能夠顯著抑制 HepG2細胞的增殖，將細胞阻滯在 G0／G1期，呈濃度與時間依賴性（P＜0.05），并且同濃度、同一處理時間下，ATPR的抑 制率更高（P＜0.05）；此外，Western blot結果顯示，ATPR較 ATRA更能顯著下調 HepG2細胞中cyclinD和 CDK6蛋白表達水平（P＜0.05），而 CDK4蛋白水平在各組變化均不明顯。結論同等濃度下，ATPR抑制HepG2細胞增殖的效果明顯強于 ATRA，其機制可能是 ATPR通過下調 cyclinD和 CDK6蛋白的表達水平，造成 G0／G1期阻滯，最終導致肝癌細胞株 HepG2的增殖抑制。

肝癌；HepG2細胞；全反式維甲酸；4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯；細胞周期；細胞增殖

全 反 式 維 甲 酸 （all-trans retinoic acid，ATRA）（圖1）是維生素 A的主要活性代謝物，為維甲酸類藥物的代表，可誘導分化多種腫瘤細胞，已被廣泛用于治療急性早幼粒細胞性白血病［1］。Sait et al［2］發現 ATRA能上調腫瘤細胞中的血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促進腫瘤血管的生成而引起惡性增殖。此外，ATRA還可產生較強的維甲酸綜合征，長期使用會產生維甲酸抵抗，限制了其在腫瘤治療中的作用［3］。因此，開發低毒高效的新型維甲酸衍生物是必需的。4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 （4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR）（圖2）是由本校合成的新型維甲酸衍生物，研究［4-6］表明在抑制細胞遷移與誘導分化和凋亡方面，ATPR效果明顯優于 ATRA。然而關于 ATPR對肝癌細胞株 HepG2增殖的研究較少，相關的機制尚不清楚。該研究以肝癌細胞株 HepG2為模型，通過比較 ATRA與 ATPR對其增殖能力的影響，為新型維甲酸衍生物用于肝癌臨床治療提供科學依據。

圖1 ATRA結構式

圖2 ATPR結構式

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細胞株 HepG2購自美國 ATCC公司；ATPR由安徽醫科大學藥學院提供；ATRA、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國 Sigma公司；低 糖 DMEM 培養基購自美國 Gibco公司，4℃儲存備用；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，-20℃保存，用前 4℃融化，無需滅活；Coulter DNA檢測試劑盒購自美國 Beckman Coulter公 司；鼠 抗 人 β-actin購 自 美 國 Santa Cruz公司；鼠抗人 cyclinD、CDK6以及兔抗人 CDK4抗體購自上海聯世生物科技有限公司；辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG、ECL顯色試劑盒以及 BCA定量試劑盒均購自美國 Pierce公司。ATRA、ATPR用 DMSO溶解配制成 20 mmol／L，-20℃避光保存，使用時用完全培養基稀釋至使用濃度。

1.2 方法

1.2.1細胞株以及細胞培養 人肝癌細胞株HepG2用含 10%新生牛血清的低糖 DMEM培養基，并加入青霉素 100 U／ml和鏈霉素 100μg／m l，在 37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。每 2～3 d換一次液，當細胞密度達 80% ～90%，用 0.25%胰酶（含 0.53 mmol／L EDTA）傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞增殖實驗（MTT法） 收集對數生長期細胞，以 2.5×107／L的密度接種于 96孔板，每孔200μl，邊緣孔用 200μl PBS填充。待細胞貼壁后棄去培養液，用 PBS輕洗 3遍，然后分別加入含有不同濃度（5、12.5、20、25、50、75、100μmol／L）的ATRA和 ATPR的培養液孵育 48 h，以及同一濃度（25μmol／L）ATRA和 ATPR處理不同的時間（24、48、72、96 h），并設置細胞對照組、溶劑對照組（DMSO），其中溶劑對照組是與最大濃度 100μmol／L藥物中所含有的 DMSO等體積，其他藥物組均將 DMSO體積補齊至最大體積，以消除各組溶劑體積不同所造成的干擾。指定作用時間后，每孔加入 20μl MTT，于細胞培養箱中孵育 4～6 h。小心棄去上清液，每孔加入 100μl DMSO，37℃振動 15 min以溶解結晶，酶 標 儀 檢 測 570 nm 波 長 吸 光 度 （optical density，OD）。每個濃度設置 6個復孔，做 3次實驗，取平均值。抑制率（%）=（對照組 OD570-試驗組 OD570）／對照組 OD570×100%。用 SPSS 16.0計算藥 物 的 半 數抑制濃度 （half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3流式細胞術檢測細胞周期 收集處于對數生長期的 HepG2細胞，接種于 6孔板，待細胞貼壁后換成無血清培養基饑餓24 h，使細胞周期同步化，然后用含 25μmol／L的 ATRA和 ATPR的完全培養液處理細胞，48 h后常規消化收集各組細胞，預冷PBS洗3次后，用100μl PBS重懸并調整細胞密度為 1×106／ml。按 Coulter DNA檢測試劑盒操作，每組加入50μl固定破膜劑，反應30 s后立即加入500 μl PI染液，室溫避光反應 30 min后用流式細胞儀檢測，每個標本檢測 105個細胞，重復計數 3次，由ModFIT軟件分析 G0／G1、S、G2／M期細胞比例。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 5、25μmol／L的 ATRA和 ATPR分別處理 HepG2細胞 48 h后，取出細胞，用預冷的 PBS洗滌 3遍，在濾紙上控干PBS，并吸去殘余 PBS。然后每組加入 200μl蛋白提取緩沖液（Tris-HCl，pH 7.14，150 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，5 mg／ml Leupeptin，1 mmol／L PMSF），冰 上 放 置 20 min后，置冰上用細胞刮刮取細胞，移入 1.5 ml EP管，并反復凍融 3次（-80℃、4℃）。之后，在超速冷凍離心機中 4℃、14 000 r／min離心 30 min，吸取上清液，使用 BCA試劑盒定量，用生理鹽水調整至相同濃度后，加入等體積的 4×蛋白上樣緩沖液，煮沸 8～10 min，-80℃保存待用。等量的各組樣品用于 SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉移到 PVDF膜上。轉膜成功后，室溫下用含 5%的脫脂奶粉封閉2 h或者4℃封閉過夜，接著將膜放入用一抗稀釋液配制的一抗中，4℃孵育過夜。經 TBST（含 0.05% Tween-20）洗滌 3遍后加入相應濃度 HRP標記的二抗室溫孵育 2 h，用 TBST洗滌 3遍后，TBS洗滌 1遍，每遍 10 min。在暗室中將等比例混合后的 ECL試劑 A液和 B液均勻涂于膜上，X線片曝光，顯影，定影。底片掃描后使用 Quantity One軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統計學處理采用 SPSS 16.0軟件進行分析，實驗數據均以 ˉx±s表示；組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 ATRA和ATPR對HepG2細胞增殖的影響

MTT結果顯示，當細胞經不同濃度的 ATRA和ATPR處理 48 h后，與細胞對照組相比，低濃度的ATRA組（5、12.5、20、25μmol／L）對細胞無抑制作用，當作用濃度升至 50μmol／L，開始以劑量依賴方式抑制 HepG2細胞株的增殖（FATRA=53.919，P＜0.05），而 ATPR組從低濃度到高濃度均能抑制細胞的生長，并呈濃度依賴關系（FATPR=8 269.029，P＜0.05），見圖3。通過 SPSS 16.0計算出 ATRA和ATPR的 IC50分別為 102.190、31.723μmol／L。隨后選取 25μmol／L藥物濃度分別作用于 HepG2細胞24、48、72、96 h，隨著藥物處理時間的延長，抑制率逐漸升高。相比之下，同一處理時間下 ATPR較ATRA的抑制率更高（F24h=44.499，F48h=271.387，F72h=1 479.019，F96h=2 130.531，P＜0.05），見圖4。以上結果均提示，與同一濃度的 ATRA相比，ATPR對 HepG2細胞增殖抑制作用更強。

圖3 不同濃度的 ATRA及 ATPR對 HepG2細胞增殖的作用1：細胞對照組；2：溶劑對照組；3：5μmol／L；4：12.5μmol／L；5：20μmol／L；6：25μmol／L；7：50μmol／L；8：75μmol／L；9：100μmol／L；與細胞對照組比較：*P＜0.05

圖4 ATRA和 ATPR對 HepG2細胞增殖的作用1：細 胞對 照組；2：溶 劑 對 照 組；3：ATRA 25μmol／L；4：ATPR 25 μmol／L；與細胞對照組比較：*P＜0.05；與同一時間的 ATRA組比較：＃P＜0.05

2.2 ATRA以及ATPR對HepG2細胞周期的影響25μmol／L ATRA和 ATPR處理 HepG2細胞 48 h后，流式細胞術檢測細胞周期顯示，與溶劑對照組相比，25μmol／L的 ATPR能夠顯著抑制 HepG2細胞增殖（P＜0.05），使 G0／G1期細胞的比例明顯增加，而 同 濃 度 的 ATRA 組 無 明 顯 作 用 （FG0／G1= 123.523，FS=74.587，FG2=63.385），見圖5。以上結果提示 ATPR能將 HepG2細胞周期阻滯在 G0／G1期，從而抑制細胞增殖。

2.3 ATRA及ATPR對HepG2細胞中cyclinD、CDK 4和CDK 6蛋白水平的影響5、25μmol／L ATRA和 ATPR作用細胞 48 h后，與細胞對照組相比，ATPR能明顯下調 cyclinD與 CDK6的水平（P＜0.05），而 ATRA 組 變 化 不 顯 著 （FcyclinD=65.190、FCDK6=65.651）。同時，CDK4蛋白的表達水平在各組中均變化不明顯（FCDK4=5.298），見圖6。

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，經治療的早期肝癌，5年生存率僅為 50%，占惡性腫瘤死亡率的第二位［7-8］。除手術切除外，藥物化療是治療肝癌的重要手段，但由于療效缺乏特異性，并且長期用藥會產生 耐 性，從 而 影響了藥物 治 療 效 果［9］。因此，尋找高效、安全的新型抗癌藥是必要的。本實驗室采用的 ATPR是在 ATRA的結構基礎上進行羧基改造而成。研究［4-5，10］證實，ATPR可以有效抑制肺癌細胞株 A549、胃癌細胞株 BGC-823以及乳腺癌細胞株 MDA-MB-231的遷移。

細胞增殖是通過細胞分裂方式增加細胞數量的復雜過程，是細胞生命活動的重要特征之一。然而，當正常細胞在多種因素的影響下，細胞周期調節失控，獲得自主生長信號，導致細胞無限增殖，就會產生腫瘤［11］，肝癌的發生發展也是肝癌細胞無限增殖的結果。因此，該文主要從細胞增殖方面，研究 ATRA與新型維甲酸衍生物 ATPR對肝癌 HepG2細胞株的作用。MTT實驗顯示，ATPR從低濃度到高濃度（5～100μmol／L）均能夠抑制 HepG2細胞的增殖，有濃度依賴性和時間依賴性，抑制率遠遠高于同等濃度下的 ATRA，即在相同濃度與作用時間下，ATPR抑制 HepG2細胞增殖的能力比 ATRA更強。

圖5 ATRA與 ATPR對肝癌 HepG2細胞周期的影響A：溶劑 對照組 ；B：ATRA 25μmol／L；C：ATPR 25μmol／L；與溶 劑對 照組 比較：*P＜0.05

圖6 ATRA和 ATPR對 HepG2細胞 內 cyclinD、CDK 4和 CDK 6蛋白表達的影響1：細胞對照 組 ；2：溶 劑 對 照 組 ；3：ATRA 5μmol／L；4：ATRA 25 μmol／L；5：ATPR 5μmol／L；6：ATPR 25μmol／L；A：ATRA和 ATPR對HepG2細胞內 cyclinD蛋白的影響；B：ATRA和 ATPR對 HepG2細胞內 CDK4和 CDK6蛋白表達的影響；與細胞對照組比較：*P＜0.05；與相同濃度的 ATRA組比較：＃P＜0.05

細胞周期檢測點是細胞增殖調控的關鍵位點，包括細胞周期蛋白 cyclin和細胞周期蛋白依賴性激酶 CDK的調控系統［11］。流式細胞術檢測細胞周期發現，ATPR可以顯著導致 HepG2細胞阻滯在 G0／G1期，抑制細胞增殖，這與MTT結果是一致的。CyclinD蛋白在細胞增殖過程中發揮重要作用，是調節 G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白，其可與 CDK4或CDK6形成激酶復合物，使關鍵底物 PRb磷酸化，加快釋放轉錄因子 E2F，從而加速 G1／S期轉換［11-12］。細胞周期的失控會導致細胞惡性增殖，從而導致癌癥［11，13］，因此，開發抗癌藥物來抑制細胞周期的進程顯得尤為重要。有研究［14］表明，在食管癌細胞株EC-9706和乳腺癌細胞株 MDA-MB-231中，通過抑制 cyclinD和 CDK4的水平，能夠誘導細胞 G0／G1期阻滯，從而抑制細胞增殖。因此，本研究檢測了 cyclinD、CDK4和 CDK6蛋白，結果顯示，經 ATPR處理48 h后的 HepG2細胞 cyclinD和 CDK6表達降低，而 CDK4蛋白水平恒定。因此，ATPR可能通過下調 cylinD和 CDK6蛋白水平來減少 cyclinD和 CDK6復合物的形成，抑制細胞周期 G1向 S期轉變，致使細胞阻滯在 G0／G1期，最終實現對 HepG2細胞的增殖抑制作用。

本實驗研究中，ATRA較其衍生物 ATPR對 cyclinD及 CDK6的抑制能力較弱，這可能與二者調節肝癌 HepG2細胞增殖方面存在不同的作用機制有關。研究［15］顯示 ATRA及其衍生物通過其核受體發揮抗癌作用，目前已發現兩種維甲酸受體家族：RARs和 RXRs家族，分別都有 α、β、γ3個亞型。ATRA與其衍生物通過與細胞內相應維甲酸受體結合后，特異性結合到靶基因調控區的維甲酸應答元件（RARE）上，選擇性地激活或抑制基因轉錄，調節細胞的增殖、分化和凋亡［15］。研究［5］證明 在胃癌BGC-823細胞中，ATPR較 ATRA能顯著下調 RARα和 RARβ受體，導致 ATPR抑制 BGC-823細胞遷移的能 力 更 強。因 此，ATRA 與 ATPR 調 節 肝 癌HepG2細胞增殖機制的不同可能與其進入 HepG2細胞內結合不同的維甲酸受體有關，二者對受體調節的研究也正在本實驗室進行。

綜上所述，在同等濃度下，新型維甲酸衍生物ATPR較 ATRA更能顯著抑制肝癌細胞株 HepG2的增殖。其機制可能是通過下調 cyclinD和 CDK6的表達水平阻滯 HepG2細胞周期進展，從而抑制細胞增殖，為肝癌的藥物治療提供了新的實驗依據。然而，細胞增殖是一個極其復雜且受嚴格調控的過程，ATPR如何下調 cyclinD和 CDK6的機制以及相關通路仍不清楚，有待后續研究進一步探討。

［1］Siddikuzzaman，Guruvayoorappan C，Berlin Grace V M.All trans retinoic acid and cancer［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33（2）：241-9.

［2］Saito A，Sugawara A，Uruno A，et al.All-trans retinoic acid induces in vitro angiogenesis via retinoic acid receptor：possible involvement of paracrine effects ofendogenous vascular endothelialgrowth factor signaling［J］.Endocrinology，2007，148（3）：1412-23.

［3］Su Y C，Dunn P，Shih L Y，et al.Retinoic acid syndrome in patients following the treatmentof acute promyelocytic leukemiawith all-trans retinoic acid［J］.Chang Gung Med J，2009，32（5）：535-42.

［4］Fan T T，Cheng Y，Wang Y F，et al.A novel all-trans retinoid acid derivative N-（3-trifluoromethyl-phenyl）-retinamide inhibits lung adenocarcinoma A549 cell migration through down-regulating expression ofmyosin light chain kinase［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（18）：7687-92.

［5］Hu A，Yang Y，Zhang S，et al.4-Amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate inhibits themigration of BGC-823 human gastric cancer cells by downregulating the phosphorylation level of MLC II［J］.Oncol Rep，2014，32（4）：1473-80.

［6］周佳麗，顏蘊文，江巧玲，等.全反式維甲酸及其衍生物對乳腺癌細胞株 MDA-MB-231凋亡的影響［J］.安徽醫科大學學報，2015，50（2）：154-8.

［7］Koudah S，EIMouhadi S，ArrivéL.Fibrolamellar hepatocellular carcinoma［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2012，36（1）：5-6.

［8］Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［9］Abrams P，Marsh JW.Current approach to hepatocellular carcinoma［J］.Surg Clin North Am，2010，90（4）：803-16.

［10］王 北，顏韻文，周 青，等.4-氨基-2-三氟甲基維甲酸酯對乳腺癌細胞株 MDA-MB-231遷移的影響及其可能機制［J］.安徽醫科大學學報，2013，48（2）：115-9.

［11］周春燕，馮作化.醫學分子生物學［M］.北京：人民衛生出版社，2014：152-4.

［12］Okayama H.Cell cycle control by anchorage signaling［J］.Cell Signal，2012，24（8）：1599-609.

［13］Lange C A，Yee D.Killing the second messenger：targeting loss of cell cycle control in endocrine-resistant breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2011，18（4）：C19-24.

［14］Wang H，Chen X，Chen Y，et al.Antitumor activity ofnovel chimeric peptides derived from cyclinD／CDK4 and the protein transduction domain 4［J］.Amino Acids，2013，44（2）：499-510.

［15］Soprano D R，Qin P，Soprano K J.Retinoic acid receptors and cancers［J］.Annu Rev Nutr，2004，24：201-21.

Effects of a novel all-trans retinoid acid derivative 4-am ino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on the proliferation of HepG2 cells

Liu Hui，Zhou Qing，Wang Yuan
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，AnhuiMedical University；Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the effects of4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate（ATPR）on the proliferation of human hepatocellular carcinoma（HCC）HepG2 cells and preliminarily clarify the probable mechanisms. Methods HepG2 cells were used as the research model and treated with all-trans retinoic acid（ATRA）and ATPR respectively.The viability of HepG2 cells was investigated by MTT assay.Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution.The expression of cyclinD，cyclin-dependent kinase 4（CDK4） and CDK6 proteins in HepG2 cellswere detected by Western blot.Results ATPR significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-and time-dependentmanner compared with cell group and arrested cells on G0／G1phase（P＜0.05）. The inhibition rate of ATPR wasmuch higher than that of ATRA at the same dose for the indicated time（P＜0.05）.In addition，Western blot results showed that ATPR down regulated the expression of cyclinD and CDK6 more dramatically than ATRA（P＜0.05），while CDK4 expression was constant in all groups.Conclusion ATPR exhibits a better inhibitory effect on HepG2 cells proliferation than ATRA.The mechanism may be partly through down regulating the expression of cyclinD and CDK6 to cause G0／G1arrest，which finally leads to growth inhibition.

hepatocellular carcinoma；HepG2 cells；all-trans retinoic acid；4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate；cell cycle；cell proliferation

R 735.7；R 966；R 34

A

1000-1492（2016）02-0156-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.004.htm l

2015-11-17接收

國家自然科學基金（編號：81272399）；安徽省自然科學基金（編號：090413116）

安徽醫科大學分子生物學實驗室、生物化學與分子生物學

教研室、安徽省 ／省部共建教育部重要遺傳病基因資源利用重點實驗室，合肥 230032

劉 慧，女，碩士研究生；

汪 淵，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：aydesm-1＠163.com