Survivin基因沉默抑制食管癌 Eca-109細胞的侵襲與遷移

牛朝霞，張秀芝，陳 潔，楊紅梅，王 黎，裴 瑞

Survivin基因沉默抑制食管癌 Eca-109細胞的侵襲與遷移

牛朝霞，張秀芝，陳 潔，楊紅梅，王 黎，裴 瑞

目的應用 RNA干擾（RNAi）技術沉默食管癌細胞Eca-109內源性 survivin的表達，探討 survivin基因在食管癌細胞侵襲與遷移過程中的作用。方法構建靶向 survivin基因的 siRNA表達載體并借助脂質體穩定轉染食管癌細胞；Western blot檢測 survivin蛋白表達水平觀察基因沉默效果，同法觀察細胞內基質金屬蛋白酶-2（MMP2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP9）和血管內皮生長因子 （VEGF）蛋白水平的變化；Transwell小室法檢測細胞侵襲能力的變化，細胞劃痕實驗觀察細胞遷移能力的改變。結果與對照組相比，干擾組survivin蛋白表達水平明顯降低，抑制率可達 85%；干擾組細胞 MMP2、MMP9和 VEGF蛋白表達受到明顯抑制（P＜0.05），同時觀察到干擾組細胞的侵襲與遷移能力也明顯下降（P＜0.05）。結論survivin基因與食管癌細胞的侵襲遷移潛能相關，特異性沉默 survivin基因可能通過下調 MMP2、MMP9和 VEGF的表達顯著抑制食管癌細胞 Eca-109的侵襲與遷移能力。

RNA干擾；survivin；侵襲與遷移；Eca-109

食管癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，而中國是全球食管癌高發地區之一，平均每年有數十萬人死于食管癌［1］。近年來隨著外科技術的進展和新輔助治療手段的應用，部分患者的病情得到了相當的改善，但術后5年生存率依然較低，因此食管癌仍是一種預后較差的惡性疾?。?］。究其原因主要是缺乏對食管癌高侵襲性和高轉移能力的惡性生物學行為的認識，進而缺乏針對食管癌患者有效的早期診療手段。因此，對食管癌細胞侵襲與遷移能力的相關研究將有助于進一步提高食管癌患者的療效及預后。Survivin作為近年研究的熱點基因之一，其主要功能是抑制細胞凋亡、保護細胞生存，參與腫瘤血管形成，并與腫瘤的浸潤、轉移相關［3-4］。目前已證實 survivin基因在正常成人組織中表達甚少，而在絕大多數腫瘤組織中存在高表達，并且該基因表達與食管 癌 的 診斷、治療及預后 密 切 相 關［5］。因此，抑制 survivin基因表達將可能成為食管癌的診療新靶點，從而減少食管癌的轉移復發，提高患者的術后生存率。該研究利用 RNA干擾技術將設計合成好的靶向 survivin基因的 siRNA轉染食管癌細胞Eca-109，從體外實驗中探討抑制 survivin基因對食管癌細胞侵襲與轉移能力的影響，以期獲得有意義的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人食管癌 Eca-109細胞由上海細胞生物研究所建；RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco公司；脂質體購自美國Invitrogen公司；引物 DNA、BamH1／HandⅢ限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購自大連寶生物公司（中國 TaKaRa公司）；蛋白質分子量標準購自美國 Promega公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒均購自美國 Pierce公司；質粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；Survivin和 β-actin抗體購自美國 Santa Cruze公司；干擾質粒 pRNAT-U6.1／Neo、陰性對 照干擾質 粒siRNA購 自 美 國 Gencript公 司；pRNAT-siRNA-survivin干擾質粒由本室構建；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人食管癌 Eca-109細胞培養于含 10%FBS的 RPMI1640培養基中，置于 37℃ 5% CO2的培養箱內培養，待細胞融合度達約 70% ～80%時，以 0.25%胰蛋白酶進行消化與傳代。

1.2.2靶向 survivin的寡核苷酸序列的設計 利用生物信息學軟件，本研究針對 survivin基因 487～505 bp的靶位點設計兩條互補的 DNA鏈，其序列分別為 5′-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGA AGCCACAGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTCTTTTT TA-3′和 3′-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTC GGTGTCTACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAGAAAAAA TTCGA-5′，兩條 DNA鏈的結構均為 BamH1+正義序列 +莖環序列 +反義序列 +轉錄終止子 +HindⅢ，在細胞內形成所謂的“發夾結構”。

1.2.3siRNA表達質粒的構建 載體 pRNAT-U6. 1／Neo經 BamH1和 HindⅢ雙酶切后與由公司合成的靶向 survivin的寡核苷酸退火后連接，并進行轉化、挑克隆、質粒抽提、菌落 PCR鑒定及測序，得到針對 survivin的 siRNA表達質粒：pRNAT-siRNA-survivin，同法構建無關干擾陰性對照質粒：pRNAT-siRNA-control，最后兩質粒分別大量抽提后備用。

1.2.4細胞轉染 待 Eca-109細胞至對數生長期即細胞生長融合度約 90%時，將干擾質粒 pRNAT-siRNA-survivin和陰 性 對 照 質 粒 pRNAT-siRNA-control按照 Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明分別轉染 Eca-109細胞，48 h后用 G418篩選 2～3周，可見典型的抗性克隆，擴大培養，建成穩定轉染細胞系，可分 別 命 名 為 Eca-109／si-survivin和 Eca-109／sicontrol。

1.2.5Western blot檢測 survivin基因沉默效果

將對數生長期的干擾組 Eca-109／si-survivin、陰性對照組 Eca-109／si-control及未轉染空白 對照組 Eca-109細胞按蛋白抽提要求進行處置，取各組細胞0.05 mg總蛋白進行不連續 SDS-聚丙烯酰胺電泳；電泳結束后，用半干石墨電轉移 2 h將分離出的蛋白質轉移至硝酸纖維膜上，用1×PBS配制的 5%脫脂奶粉在室溫搖床上封閉 1～2 h，加入鼠抗人單克隆一抗，4℃過夜孵育，洗膜，再加入相應二抗，室溫孵育 1.5 h，再洗膜，經 ECL化學發光檢測和拍照，其中以 β-actin作為內對照，結果通過灰度掃描從蛋白表達水平對比觀察干擾前后 survivin的不同表達。

1.2.6Western blot檢測 survivin基因沉默后對基質金屬蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2，MMP2）、基 質 金 屬 蛋 白 酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）及 血 管內 皮 生 長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達的影響 取對數生長期的 干擾 組 Eca-109／si-survivin、陰 性 對 照 組 Eca-109／si-control及未轉染空白對照組 Eca-109細胞，參照上述 1.2.5中所述 Western blot實驗步驟分析干擾 survivin基因表達后對 MMP2、MMP9及 VEGF蛋白表達水平的影響。

1.2.7Transwell小室法體外檢測細胞侵襲能力將 Transwell小室置于 24孔培養板中，取 Matrigel基質膠按1：3進行稀釋后均勻鋪于微孔濾膜的上室（50μl／孔），37℃孵育箱過夜；取對數生長期的干擾組 Eca-109／si-survivin、陰 性 對 照 組 Eca-109／sicontrol及未轉染空白對照組 Eca-109細胞，常規進行胰酶消化，調 整細胞 密度為 2.5×104個 ／ml，取200μl細胞懸液小心加入濾膜上室，并加入無血清培養基，然后將 800μl含 2%小牛血清的 RPMI1640加入濾膜下室，常規培養 36～40 h后取出濾膜，置于 10%多聚甲醛固定 10 min，進行 HE染色，隨后用棉簽輕輕擦拭掉濾膜上表面的細胞，用清水浸洗 Transwell，將其置于 24孔板中，蓋上蓋，保持潮濕，顯微鏡下計數 5個高倍視野（×200）下穿過濾膜的細胞數并拍照。實驗重復2次。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將干擾組Eca-109／si-survivin、陰 性 對 照 組 Eca-109／si-control及未轉染空白對照組 Eca-109細胞分別接種于 6孔板待之長至臨近飽和，用 10μl Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，同時將細胞洗滌 2遍；加 5%小牛血清的 RPMI1640，用倒置 Nikon顯微鏡觀察 18～24 h，24 h顯示轉染和非轉染細胞的最大差別，數碼相機成像；測量各組細胞任意3個部位不同傷口的寬度，計算3次實驗細胞遷移距離的平均值。

1.3 統計學處理通過 SPSS統計學軟件進行單因素方差分析，實驗數據以 ˉx±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穩定轉染細胞株的篩選轉染 pRNAT-siRNA-survivin表達質粒的 Eca-109細胞，分別經 G418不同質量濃度的培養液進行抗性篩選，約 2周后未轉染細胞幾乎全部死亡，繼續維持抗性篩選3周后在熒光顯微鏡下觀察形成帶有綠色熒光 GFP的陽性克隆，后擴增培養備用，最終篩選維持質量濃度為400 mg／L。見圖1。

圖1 穩定轉染 pRNAT-siRNA-survivin質粒的 Eca-109細胞形成的陽性克隆 ×100

2.2 Western blot檢測干擾后survivin蛋白的表達水平以 β-actin為內對照，結果顯示陰性干擾對照組 Eca-109／si-control及未轉染空白 對照組 Eca-109細胞 survivin蛋白表達未明顯受到抑制，兩者比較無顯著性差異，而與兩對照組相比干擾組 Eca-109／si-survivin細胞 survivin蛋白 表 達 明顯受到 抑制，灰度掃描顯示沉默效率達 85%。見圖2。

圖2 W estern blot檢測干擾前后 survivin蛋白的表達1：Eca-109／si-survivin；2：Eca-109／si-control；3：Eca-109

2.3 W estern blot檢測沉默survivin基因對Eca-109細胞MM P2、MMP9及VEGF蛋白表達的影響

以 β-actin為內參，結果顯示 Eca-109／si-control和Eca-109兩對照組細胞 MMP2、MMP9及 VEGF蛋白表達水平未明顯受抑，兩者比較差異無統計學意義；而與兩對照組相比干擾組 Eca-109／si-survivin細胞MMP2、MMP9及 VEGF蛋白表達明顯降低，灰度掃描顯示下降水平達80%以上。見圖3。

圖3 Survivin基因干擾前后 Eca-109細胞 MM P2、MM P9及 VEGF蛋白的表達1：Eca-109；2：Eca-109／si-survivin；3：Eca-109／si-control

2.4 Transewell小室檢測干擾前后對Eca-109細胞侵襲能力的影響實驗中通過鏡下計數5個高倍視野腫瘤細胞從上室向下室侵襲基底膜的平均細胞數目來衡量其侵襲轉移能力，結果顯示：與陰性對照組 Eca-109／si-control及空白對照組 Eca-109相比，轉染 pRNAT-siRNA-survivin的干擾組 Eca-109細胞侵襲穿透基底膜的細胞數目明顯減少，差異有統計學意義（F=110.97，P＜0.05）。見圖4。

2.5 細胞劃痕實驗檢測干擾前后對Eca-109細胞遷移能力的影響統計分析結果顯示：劃痕 24 h時陰性對照組細胞 Eca-109／si-control與空白對照組細胞 Eca-109均檢測到明顯的劃痕間距縮短，二者對比無顯著性差異；而干擾組細胞 Eca-109／si-survivin未檢測到明顯的劃痕間距減小，與兩對照組相比差異有統計學意義（F=3.85，P＜0.05）。見圖5。

圖4 Survivin干擾前后各組 Eca-109細胞侵襲能力的改變及數據統計分析與 Eca-109／si-survivin比較：*P＜0.05

3 討論

食管癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。近年來隨著外科技術的發展完善，新的綜合治療手段不斷應用于食管癌患者，但其術后 5年生存率依然較低。研究［6］表明，食管癌患者預后不良的原因很可能與微病灶的復發轉移密切相關，因此闡明食管癌侵襲轉移的重要原因與相關機制將有利于提高患者的診斷、治療及預后。

圖5 Survivin干擾前后各組 Eca-109細胞遷移運動能力的改變及細胞遷移距離的數據統計分析與 Eca-109／si-survivin組比較：*P＜0.05

在惡性腫瘤細胞侵襲轉移的過程中，腫瘤血管生成與細胞外基質被腫瘤細胞釋放的蛋白水解酶降解是中心環節?；|金屬蛋白酶家族（MMPs）成員作為 wnt／β-catenin信號轉導通路中重要的下游調控因子，在腫瘤細胞浸潤轉移中扮演重要角色，可通過降解細胞外基質的不同蛋白成分促進腫瘤細胞的移動［7］。在 眾 多 刺 激 微 血 管 生 成 的 因 子 中 血 管VEGF能夠明顯誘導腫瘤新生毛細血管的生成，其過表達能促進血管內皮細胞分裂增殖與遷移，導致血管重建，進而加速惡性腫瘤的生長和轉移潛能［8］。研究［9］提示 MMPs的高表達與腫瘤微血管生成也密切相關，二者共同作用促使腫瘤細胞穿過基底膜屏障進入血液循環向遠處浸潤轉移。RNAi技術作為近年來研究哺乳動物細胞功能基因組學的一個新工具，具有高度序列專一性，可以特異地產生由雙鏈 DNA介導的轉錄后特定基因沉默的效果［10］；依據該原理，針對 siRNA的 RNA干擾技術當今已經廣泛應用于生物學、醫學及工程學等眾多研究領域中，同時也為臨床眾多惡性腫瘤尤其中晚期患者開辟了基因治療的新路徑，給患者將帶來新的希望，食管癌患者當然也不例外。

本研究利用 RNAi和重組體技術構建靶向 survivin基 因 的 siRNA 表 達 質 粒 pRNAT-siRNA-survivin，并成功轉染食管癌 Eca-109細胞；通過 Western blot分析顯示干擾后 survivin蛋白表達水平較對照組明顯下調，表明 RNA干擾技術成功抑制了 Eca-109細胞的 survivin基因表達；通過 Western blot實驗結果顯示抑制 survivin基因表達后能顯著下調腫瘤轉移相關蛋白 MMP2、MMP9及 VEGF的表達水平，提示 survivin基因在腫瘤轉移相關蛋白表達調控中發揮重要作用，參與惡性腫瘤的侵襲轉移。

為進一步探究 survivin基因對食管癌 Eca-109細胞侵襲轉移的影響，又開展了 Transwell體外侵襲實驗和細胞劃痕實驗；前者可模擬反映腫瘤細胞的侵襲能力，后者能較好地檢測腫瘤細胞的遷移能力。檢測結果顯示，與對照組相比靶向抑制 survivin基因的表達能顯著降低干擾組 Eca-109細胞的體外侵襲與遷移能力，再次證實 survivin基因在食管癌細胞侵襲轉移中扮演重要角色。

綜上所述，survivin基因在食管癌的侵襲遷移中發揮著重要作用，survivin基因有望成為食管癌患者分子靶向基因治療的新靶點，從而減少食管癌的轉移復發，提高患者的術后生存率。

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Survivin gene silencing inhibits the invasion and m igration of esophageal carcinoma Eca-109 cell

Niu Zhaoxia，Zhang Xiuzhi，Chen Jie，et al
（Dept of Pathophysiology，Henan Medical College，Zhengzhou 451191）

Objective To investigate the effect of survivin on Eca-109 cell invasion andmigration by silencing endogenous survivin expression by RNA interference technology.Methods A siRNA expressing vector targeting survivin was constructed and transfected into Eca-109 cells via lipofectamineTM2000 to establish stable transfection cell line；the expression level of survivin protein was detected by Western blot to observe the interference effect；the expressions ofMMP2，MMP9 and VEGF proteinswere also observed by Western blot；the changes of cell invasion and migration abilitieswere respectively detected by Transwell Matrigel invasion assay and cellwound-healing scrape assay.Results Compared with the control groups，the expression level of survivin protein was significantly reduced and the inhibition rate was85%；the expressions ofMMP2，MMP9 and VEGF proteins of survivin interference group were also distinctly surpressed（P＜0.05）；at the same time，the cell invasion andmigration abilities ofsurvivin interference group were obviously reduced（P＜0.05）.Conclusion Survivin gene expression is correlated with the invasion and migration potential of esophageal carcinoma cell；specifically silencing survivin can effectively inhibit the cell invasion and migration abilities of Eca-109 cells possibly by down-regulating the expressions of MMP2，MMP9 and VEGF proteins.

RNA interference；survivin；invasion and migration；Eca-109

R 735.1

A

1000-1492（2016）02-0185-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.016.htm l

2015-11-06接收

河南省教育廳科學技術研究重點項目（編號：14B310002）

河南醫學高等?？茖W校病理生理學教研室，鄭州 451191

牛朝霞，女，碩士，講師，責任作 者，E-mail：nzx99＠163. com