M icroRNA-133b-5p通過靶向調控Fas基因影響 H9c2心肌細胞凋亡

程 潔，何淑芳，韓正怡，朱海娟，張 野

M icroRNA-133b-5p通過靶向調控Fas基因影響 H9c2心肌細胞凋亡

程 潔，何淑芳，韓正怡，朱海娟，張 野

目 的研 究 microRNA（miR）-133b-5p在 H9c2心 肌細胞凋亡中發揮的作用及其靶向調控 Fas基因的機制。方法取對數生長期大鼠 H9c2胚胎心肌細胞，分為空白對照組、miR-133b-5p抑制劑組、抑制劑陰性對照組。分別轉染48 h后收集細胞，實時 熒 光定量 PCR（qRT-PCR）檢測 miR-133b-5p表達，微板法檢測細胞培養液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，Annexin V-FITC聯合 PI雙 染流式細 胞 術 檢 測 細 胞 凋亡。雙熒光素酶報告基因系統驗證 miR-133b-5p與 FasmRNA的 3′UTR區的靶向結合。最后運用 qRT-PCR和Western blot分別檢測各組 FasmRNA與 Fas蛋白表達水平。結果miR-133b-5p抑制劑組細胞內 miR-133b-5p表達水平下調至空白對照組的 33%（P＜0.05）；LDH活性升高，細胞凋亡率增加，均明顯高于空白對照組與抑制劑陰性對照組（P＜0.05）。雙熒光素酶報告基因證 明 Fas是 miR-133b-5p的一個靶基因；miR-133b-5p inhibitor顯著上調 FasmRNA和 Fas蛋白水平 （P＜0.05）。結論利 用 化 學 合 成 miR-133b-5p inhibitor抑制大鼠 H9c2心肌細胞中 miR-133b-5p表達，可誘導心肌細胞損傷和凋亡，其機制可能與調控靶基因 Fas表達有關。

心肌細胞；微小 RNAs；乳酸脫氫酶；凋亡；Fas

凋亡是心肌細胞的一種程序性死亡，其在心臟發育、心力衰竭、原發性高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死等心臟疾病的疾病生理中發揮著重要的作用［1］。抑制心肌細胞凋亡可以減輕心肌缺血再灌注損 傷、延 緩 心 衰 等 病 理 過 程。通 過 microRNA（miRNA）芯片對比正常與心衰大鼠心肌細胞內miRNA表達，發現與正常大鼠相比，心衰大鼠心肌細胞內 miR-133b-5p明顯下調［2］。該研究擬進一步觀察 miR-133b-5p對心肌細胞凋亡的影響及其可能機制。該實驗利用化學合成 miR-133b-5p inhibitor，將其轉染至大鼠 H9c2心肌細胞內，下調 miR-133b-5p表達，觀察其對心肌細胞損傷和凋亡的影響。通過雙熒光素酶報告基因系統驗證 miR-133b-5p與靶基因 Fas的靶向結合，并觀察 miR-133b-5p inhibitor對 FasmRNA與蛋白表達水平的影響，以探討 miR-133b-5p影響心肌細胞凋亡的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑F12／DMEM中糖培養基、TRIzol總RNA提取試劑、Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑、OPTI-MEM無血清培養基（美國 Life Technologies有限公司）；胎牛 血清、0.25%胰酶消化液（南京 Wisent生物技術有限公司）；AOMD-Q020 miRNA逆轉錄與 PCR試劑盒、U6與 miR-133b-5p引物（廣州復能基因有限公司）；mRNA RR037A逆轉錄試劑盒、DRR820A PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；β-actin與 Fas引物（上海生工生物工程有限公司）；LDH測試盒（南京建成生物工程研究所）；凋亡試劑盒（美國 Biouniquer公司）；Dual-Luciferase報告基因檢測系統試劑盒（美國 Promega公司）；鼠抗 βactin單克隆抗體、兔抗 Fas多克隆抗體（美國 Santa Cruz生物技術公司）；HRP標記羊抗兔、羊抗鼠抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Tecan M1000多功能酶標儀（瑞士 Tecan公司）；Implen P330超微量分光光度計（德國 Implen公司）；StepOne熒光定量 PCR儀（美國應用生物系統公司）；Cytomics FC 500流 式 細 胞 儀 （美 國 Beckerman Coulter有 限 公司）；CXY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Tanon Fine Do X6全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有公司）。

1.2 細胞的培養大鼠 H9c2（2-1）胚胎心肌細胞株、293T細胞株購自中科院上海細胞庫。心肌細胞株采用含有 10%胎牛血清 F12／DMEM中糖培養基、293T細胞株采用 DMEM高糖培養基，均于 37℃、5%CO2的培養箱中培養。0.25%胰酶消化細胞，每 3 d傳代 1次，取對數生長期細胞進行實驗。293T細胞用于雙熒光素酶報告基因實驗。

1.3 m iR-133b-5p m im ic、inhibitor的合成與轉染

1.3.1miR-133b-5p inhibitor的合成與心肌 細胞的轉染 miR-133b-5p inhibitor的 序 列 為 5′-ACUUGGUUCCGUUUGACCAGC-3′，為成熟 miR-133b-5p的反義 序 列；miR-133b-5p inhibitor-NC的 序 列 為 5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′，該 序 列 和 所 有的哺乳動物都沒有同源性，因此沒有功能。所有RNA片段委托上海吉瑪有限公司合成。轉染前1 d消化制備細胞懸液，以 4×104個／孔接種于 6孔板中。當細胞長至約 40% ～50%的細胞融合度時進行轉染，所 有 步 驟 按 Lipofectamine RNAiMAX操 作手冊 進 行，miR-133b-5p inhibitor轉 染 濃 度 為 30 nmol／L。實驗分成空白對照組 （只加 Lipofectamine RNAiMAX）、miR-133b-5p抑 制 劑 組 （轉 染 miR-133b-5p inhibitor）、抑制劑 陰性對 照組 （轉 染 miR-133b-5p inhibitor-NC）。

1.3.2miR-133b-5p mimic的合成與 293T細胞的轉染 miR-133b-5p mimic的 序 列 為 5′-GCUGGUCAAACGGAACCAAGU-3′，為 成 熟 miR-133b-5p序列；miR-133b-5p mimic-NC的 序 列 與 miR-133b-5p inhibitor-NC的序列相同。細胞轉染方法同前。

1.4 熒光實時定量PCR檢測RNA表達水平

1.4.1miR-133b-5p表達水平檢測 各組于轉染 48 h后收集細胞，TRIzol法提取細胞總 RNA，紫外分光光度計定量 RNA樣品。以每 10μl逆轉錄體系加入1 000 ng總 RNA，根據復能基因 AOMD-Q020 miRNA試劑盒說明書，采用 POLY A加尾法進行逆轉錄。得到的 cDNA 5倍稀釋后以 U6為內參進行熒光定量PCR，反應條件為：95℃預變性 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s（40個循環）；反應結束建立熔解曲線。用 2-ΔΔCt計算 miR-133b-5p的相對 含量。其 中U6（貨 號：RmiRQP9003）和 miR-133b-5p（貨 號：RmiRQP3012）引物均委托廣州復能基因有限公司設計合成。每組3個復孔，實驗共重復3次。

1.4.2FasmRNA表達水平檢測 同樣方法收集并定量 RNA后，以每 10μl逆轉錄體系加入 500 ng總 RNA，根據 TaKaRa RR037A逆轉錄說明書進行逆轉錄 得 到 相 應 的 cDNA。β-actin上 游 引 物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下 游 引 物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；Fas上游引物：5′-GTTGGAAAGAACCGAAGGACAA-3′，下游引物 5′-CC TCAAAGTAGGCACAGGATGT-3′。以 β-actin為內參進行熒光定量 PCR，反應條件為，95℃預變性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s（40個循環）；反應結束建立熔解曲線。用 2-ΔΔCt計算 Fas的相對含量。每組 3個復孔，實驗共重復3次。

1.5 微板法檢測LDH活性轉染 48 h后吸取各孔培養基上清液，100μl／孔。根據說明書依次加樣后，酶標儀檢測 450 nm處吸光度值。根據公式計算出 LDH活性。每組至少 3個復孔，實驗共重復 3次。

1.6 Annexin V／PI雙染流式細胞術檢測心肌凋亡

轉染 48 h后用胰酶消化收集細胞。用 PBS洗滌細胞兩次（800 rpm離心 5min），收集約 3×105個細胞。用 500μl Annexin V binding buffer懸浮細胞后，加入 1.2μl Annexin V-FITC和 3μl PI，混勻。避光，室溫反應 10 min。用流式細胞儀檢測，Annexin V+／PI-為凋亡細胞。每組 3個復孔，實驗共重復3次。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測將含有 miR-133b-5p預測結合位點的 Fas基因 3′UTR全長序列擴增產物轉入 PmirGLO表達載體（Fas-wt），并針對軟件預測的 miR-133b-5p與 Fas基因的靶結合位點進行定點突變（Fas-mut），然后利用 Lipofectamine將報告質粒 和 miR-133b-5p mimic或 其 陰 性 對 照 （miR mimic-NC）共轉染 293T細胞。Fas-wt及 Fas-mut轉染細胞分別分為空白對照組、miR-133b-5p mimic組及 mimic陰性對照組，每組 3個 復 孔。培 養 48 h后，按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，Tecan M1000多功能酶標儀檢測細胞熒光素酶的活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值／海腎熒光素酶活性值。實驗重復3次。

1.8 W estern blot檢測Fas蛋白水平轉染 48 h后胰酶消化收集細胞，加入 RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃12 000 r／min離心 30 min，收集上清液。BCA法測定各組蛋白濃度。蛋白樣品以1∶1加入蛋白上樣緩沖液，混勻后 100℃ 5 min進行蛋白變性。取 30μg蛋白經 SDS-PAGE電泳后，電轉印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h后，加入 βactin或 Fas的一抗，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育 1 h。TBST洗膜3次后進行 ECL化學發光劑顯色，Tanon Fine Do X6全自動化學發光圖像分析系統采集圖像。實驗共重復3次。

1.9 統計學處理采用 SPSS 10.0統計軟件進行分析，計量資料以 ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 m iR-133b-5p inhibitor顯著下調H9c2心肌細胞內m iR-133b-5p表達miR-133b-5p抑 制 劑 組miR-133b-5p相對表達水平為（0.33±0.17），明顯低于空白對照組（1.00±0.17）（P＜0.05），提示抑制劑轉染成功，可特異性抑制心肌細胞內 miR-133b-5p表達。相反，抑制劑陰性對照組與空白對照組miR-133b-5p表達差異無統計學意義。見圖1。

圖1 熒光定量 PCR比較各組中 m iR-133b-5p水平A：空白對 照組；B：miR-133b-5p抑制 劑組；C：抑制劑 陰性 對照組；與空白對照組比較：*P＜0.05

2.2 m iR-133b-5p inhibitor對H9c2心肌細胞LDH活性的影響與空白對照組相比，轉染 miR-133b-5p inhibitor后，心肌細胞培養液中 LDH活性明顯升高（F=11.000，P＜0.05），提示心肌細胞受損。相反，轉染 miR inhibitor-NC對心肌細胞培養液中 LDH活性無明顯影響。見圖2。

圖2 m iR-133b-5p inhibitor對 H9c2心肌細胞 LDH釋放水平的影響A：空白對 照組；B：miR-133b-5p抑制 劑組；C：抑制劑 陰性 對照組；與空白對照組比較：*P＜0.05

2.3 m iR-133b-5p inhibitor對H9c2心肌細胞凋亡的影響Annexin V／PI雙染流式檢測心肌細胞凋亡結果顯示，與空白對照組相比，miR-133b-5p抑制劑組細胞 Annexin V+／PI-區 細胞 明 顯 增 多 （F= 6.945，P＜0.05），提示細胞凋亡增加。相反，抑制劑陰性對照組心肌細胞凋亡無明顯變化。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測 m iR-133b-5p inhibitor對H9c2心肌細胞凋亡的影響A：空白對 照組；B：miR-133b-5p抑制 劑組；C：抑制劑 陰性 對照組；與空白對照組比較：*P＜0.05

2.4 m iR-133b-5p靶向結合Fas基因3′UTR包含 miR-133b-5p結合位點的 FasmRNA 3′UTR序列（Fas-wt）或其結合位點 突 變 體 （Fas-mut）pmirGLO報告質粒，被克隆至熒光素酶報告基因載體下游（圖4A）。在 Fas-wt細胞株中，共轉染 miR-133b-5p mimic可抑制 Fas基因熒光素酶活性，與空白對照組及 mimic陰性對照組相比，差異有統計學意義（F= 139.999，P＜0.05）。而在 Fas-mut細胞株中，共轉染 miR-133b-5p mimic對 Fas基因熒光素酶活性無明顯影響，與空白對照組及 mimic陰性對照組相比無明顯差異（F=0.599），見圖4B。說明 miR-133b-5p是通過靶向結合 Fas基因的 3′UTR來調節其表達。

圖4 miR-133b-5p靶向結合 Fas基因 3′UTRA：熒光素酶報告載體中插入野生型 Fas 3′UTR端（wt）或 miR-133b-5p結合位點突變的 Fas 3′UTR端（mut）；B：野生型 （Fas-wt）與突變型（Fas-mut）報告 載體 分別與 空白 載體、miR-133b-5p mimic或mimic陰性 對 照 共 轉 染 293T細 胞；1：空 白 對 照 組；2：miR-133b-5p mimic組；3：mimic陰性對照組；與空白對照組比較：*P＜0.05

2.5 m iR-133b-5p inhibitor對H9c2心肌細胞Fas m RNA和Fas蛋白水平的影響qRT-PCR檢測 Fas mRNA水平顯 示，與空白對照組相比，轉染 miR-133b-5p inhibitor后，細胞內 FasmRNA表達水平升高（F=5.091，P＜0.05），見圖5A。同 時，Western blot結果顯示 miR-133b-5p抑制劑組細胞內 Fas蛋白表達水平明顯高于空白對照組（F=9.019，P＜0.05），見圖5B；提示 miR-133b-5p在 mRNA和蛋白水平調控 Fas表達。相反，轉染 miR inhibitor-NC對FasmRNA和蛋白水平均無明顯影響。

3 討論

圖5 m iR-133b-5p inhibitor對 Fasm RNA和 Fas蛋白水平的影響1：空白對照組；2：miR-133b-5p抑制劑組；3：抑制劑陰性對照組；A：以 β-actin為內參，qRT-PCR分析 FasmRNA表達；B：以 β-actin為內參，Western blot分 析 Fas蛋 白 表 達；與 空 白 對 照 組 比 較：*P＜0.05

miRNA是一類小分子非編碼單鏈 RNA，通常只有 18～24個堿基，通過與靶基因 3′UTR區域的結合，以降解靶基因 mRNA或者抑制靶基因翻譯兩種方式達到基因沉默效應［3-4］。miRNA幾乎參與調控人類生長發育的各個階段，據預測，人類可能有超過90%基因受到 miRNA的調控［4］。miRNA可通過其下游的靶基因和信號通路，調控心肌細胞的凋亡過程［5］，從而使 miRNA成為臨床治療和預防心肌細胞凋亡相關疾病的靶標之一。

在細胞內有效地抑制目的 miRNA表達，利用脂質體轉染寡核苷酸是一種簡便有效的方法。miRNA inhibitor通過特異性地與成熟 miRNA分子結合而抑制其作用，削弱細胞中 miRNA導致的基因沉默效應［5］。本實驗采用的 miR-133b-5p inhibitor為 2′-甲氧修飾的 RNA寡核酸設計，可以有效抑制內源性成熟 miRNA的功能。利用 RNA特異性轉染試劑 Lipofectamine RNAiMAX，進 一 步 提高 了 細 胞轉 染 效率。轉染 48 h后利用 qRT-PCR檢測心肌細胞內miR-133b-5p表達，驗證了抑制劑轉染成功。

miR-133家族主要包括 miR-133a和 miR-133b，其中 miR-133a已被證實是一種重要的抗心肌細胞凋亡 miRNA，其可能通過靶向抑制 caspase-9抑制心肌細胞 凋 亡［6-7］。 研 究 表明，miR-133a可 以 靶 向 調控 cyclinD2，調節心肌細胞增殖［8］；在主動脈結扎和異丙腎上腺素誘導的心肌肥大模型中，miR-133a可以發揮抑制心肌纖維化、改善電生理作用［9］；miR-133a的敲除會導致鼠發生室間隔缺損、擴張性心肌病［8］。miR-133b與 miR-133a具 有高度 同源性，可能有類似生物學功能，兩者在心肌梗死后心肌組織中表達均顯著降低［10］。然而 miR-133b在心肌細胞凋亡中發揮何種作用仍不明確，其作用機制尚待闡明。miR-133b-5p是 miR-133b前體自 5′端臂加工得到的 成 熟 體。本 研 究 中，利 用 miR-inhibitor下 調H9c2心肌細胞內 miR-133b-5p表達，導致 LDH活性升高，細胞凋亡率增加，提示 miR-133b-5p表達下調可誘導心肌細胞損傷和凋亡。因而，miR-133b-5p在心肌細胞中可能有抗損傷和凋亡的作用，維持或上調 miR-133b-5p表達可能有利于心肌細胞生存。

本實驗運用生物信息學分析與雙熒光素酶實驗證實 Fas是 miR-133b-5p的直接靶基因之一，而且miR-133b-5p inhibitor可顯著上調 FasmRNA和 Fas蛋白表達。miRNA作用于靶基因的方式主要有兩種：一種是使靶基因 mRNA降解，另一種是抑制靶基因 mRNA翻譯［3］。基于本實驗 結果，推測 miR-133b-5p可能是通過前一種方式作用于其靶基因Fas發揮作用。Fas是一種分子量為 48 ku的跨膜糖蛋白，其與 FasL結合后介導的凋亡通路是經典的凋亡 途 徑 之 一［11］。 Fas／FasL 激 活 后，級 聯 激 活caspase-8、caspase-3、6、7、9等，作用于線粒體或者轉錄因子，最終導致凋亡發生［12］。在心肌細胞中下調Fas可以 有效減輕心肌細胞 凋 亡［13］。因 此，推 測miR-133b-5p inhibitor下調心肌細胞內 miR-133b-5p表達，并且可能通過上調 FasmRNA和 Fas蛋白表達，誘導活化 Fas／FasL信號通路，致使心肌細胞發生損傷和凋亡。

綜上所述，利用 miR-133b-5p inhibitor抑制大鼠H9c2心肌細胞中 miR-133b-5p表達水平，可誘導心肌細胞損傷和凋亡，其機制可能是通過在 mRNA和蛋白水平調控 Fas表達，誘導活化 Fas介導的細胞凋亡信號。為進一步探討 miR-133b-5p在心肌細胞凋亡中發揮的作用及其機制提供了基礎。

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Effects of m icroRNA-133b-5p on cell apoptosis by targeting Fas gene in m yocardial H9c2 cells

Cheng Jie，He Shufang，Han Zhengyi，et al
（Dept of Anesthesiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effects ofmiR-133b-5p on cell apoptosis in H9c2 cells and the mechanisms ofwhich targeting Fas gene.Methods H9c2 cells in logarithmic phase were divided into the CON group，themiR-133b-5p inhibitor group，and themiR inhibitor-NC group.The cells in different groupswere collected after 48 h transfection to examine miR-133b-5p level by qRT-PCR.The activity of lactate dehydrogenase（LDH）in the culturemedium wasmeasured by colorimetric kit.Cell apoptosis was determined by flow cytometry after Annexin V／PIdouble staining.Dual luciferase reporter assay was performed to confirm the direct regulation ofmiR-133b-5p on the 3′UTR of target gene Fas.Finally，the levels of Fas mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot，respectively.Resu lts The level ofmiR-133b-5p in miR-133b-5p inhibitor group was reduced to 33%as compared with the CON group（P＜0.05）.Inhibition ofmiR-133b-5p led to elevated LDH activity and increased apoptosis rate as compared with the CON group ormiR inhibitor-NC group（P＜0.05）.Dual luciferase reporter assay results confirmed that Faswas a target gene ofmiR-133b-5p.In addition，miR-133b-5p inhibitor obviously up-regulated the levels of FasmRNA and Fas protein（P＜0.05）.Conclusion The chemically synthesized miR-133b-5p inhibitor could effectively inhibitmiR-133b-5p expression in H9c2 cells，leading to cell injury and apoptosis，and itsmechanism might involve the regulation on Fas expression.

myocytes，cardiac；microRNAs；lactate dehydrogenase；apoptosis；Fas

R 363

A

1000-1492（2016）02-0189-06

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.018.htm l

2015-11-23接收

安徽高校省級自然科學研究重大項目 （編號：KJ2014ZD16）；安 徽 省 科 技 廳 年 度 重 點 項 目 （編 號：1301043030）

安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，合肥 230601

程 潔，女，碩士研究生；

張 野，男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：zhangye_hassan＠sina.com